外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物遗传工程领域，特别是涉及一种外源线粒体导入到哺乳动物细胞 中的方法。
【背景技术】
[0002] 线粒体是真核生物最重要的细胞器，负责了细胞90% W上的能源供给，线粒体携 带独立的基因组，线粒体DNA，具有与核基因组不同的独立的基因转录和蛋白翻译结构，哺 乳动物细胞线粒体DNA编码了 22条tRNA，2条rRNA，13条多肤。该些编码的多肤是线粒体 进行有氧呼吸作用的各种蛋白复合体中非常关键的亚基，大量的研究表明，该些多肤的突 变或表达降低均能明显抑制细胞有氧呼吸作用。
[0003] 随着近代分子生物学的飞速发展，人类已经可W实现在核基因组中进行各种基因 改造活动，如基因导入、基因敲除、定点突变、基因重排等等。然而，截至目前，人类对于线 粒体的基因改造技术还非常不成熟，目前仅能在酵母等低等真核生物中实现线粒体基因改 造，却一直没能在高等哺乳动物中实现。针对哺乳动物线粒体改造，目前已经报道的有多种 尝试的方案，但总体而言，仍然没能真正实现。一种方案是在核基因组中表达目的基因，增 加定位序列后导入线粒体，该种方案存在一些问题：首先，哺乳动物线粒体基因组大部分基 编码的是功能RNA，而目前核基因组编码的RNA进入线粒体的机制还不是很清楚，已知的需 要增加一段定位RNA序列，但该段序列是否会影响目标RNA的功能还是未知。另一方面，经 过亿万年的进化，目前留在哺乳动物线粒体基因组中的该13条多肤与大部分核基因有很 大不同，在核基因组中表达该些多肤有存在细胞毒性的可能，且该些多肤往往疏水性很强， 不利于核基因组表达。第二种方案是开发线粒体特异性的转染介质，将目标基因转染进入 线粒体。该方面有很多的文献报道，但由细胞外侧跨越H层膜结构而将目标核酸转入线粒 体，是非常困难的，已经报道的例如地唾氯馈质体（DQAsome)、聚己帰亚胺（PEI)及衍生物 等等方法成功者寥寥无几，且已有的文献报道的方法引用率低，重复性不佳，因此该类方法 也无法真正实现目标。第H种方案是利用核移植或者细胞胞质体杂交等技术，增加外源性 野生型线粒体的比例从而实现改造线粒体遗传行为。该类方法无法根除内源性的线粒体和 DNA，且该类方法会额外增加大量的外源细胞质成分，会带来一些不确定因素。第四种方案 是表达祀向线粒体的TALEN分子，实现目标序列的破坏。该种方法已报道能成功破坏大片 段缺失和特定点突变的线粒体DNA，是目前已报道的最有效的改造线粒体DNA的技术方法。 但该方法依然存在很多的不足，一方面，对于特定的点突变，TALEN能否实现特异性选择目 标序列仍有很多的疑问，另一方面，该方法只能针对性的破坏特定序列，还没法做到定点基 因改造和基因导入。人类发现线粒体已经一百多年，发现线粒体DNA并致力于实现线粒体 DNA改造也有几十年的时间，但直到目前，仍没能实现哺乳动物中线粒体DNA的有效基因改 造，有效的哺乳动物线细胞内粒体基因改造技术是一个世界级的技术难题。
[0004] 化aig J. Venter实验室2010年成功利用合成生物学技术获得了人工合成的小鼠 线粒体DNA全序列，但没有对其进行任何改动，也未实现人工合成线粒体DNA在线粒体W及 在哺乳动物细胞内的表达和功能鉴定。
【发明内容】
[0005] 基于此，本发明的目的之一在于提供一种含有外源线粒体的哺乳动物细胞。
[0006] 实现该目的的技术方案如下：
[0007] 含有外源线粒体的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞具有内吞功能（内吞作用）。
[0008] 所述线粒体是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到的人工合成线 粒体，也可是分离得到的哺乳动物细胞线粒体。
[0009] 所述外源DNA可W是人工合成的线粒体DNA，也可W是分离得到的DNA，在其中一 个实施例中，所述外源DNA是人工合成的线粒体DNA，其来源不受限制。
[0010] 在其中一个实施例中，所述人工合成的线粒体DNA是经过人工基因改造的哺乳动 物细胞线粒体DNA。当然，所述人工合成的线粒体DNA也可W是野生型哺乳动物细胞线粒体 DNA。
[0011] 本发明所述的哺乳动物细胞，是指具有内吞功能的细胞，最优选的是巨瞻细胞。
[0012] 本发明的另一目的是提供上述含有外源线粒体的细胞的制备方法。
[0013] 具体技术方案如下：
[0014] 上述含有外源线粒体的哺乳动物细胞的制备方法，包括W下步骤：将所得外源线 粒体加入到培养有具有内吞作用的哺乳动物细胞的细胞培养体系中，继续培养，即得含有 外源线粒体的细胞。
[0015] 在其中一个实施例中，所述哺乳动物细胞是巨瞻细胞；所述培养条件；36-38°C， 水饱和密闭培养箱，4. 5-5. 5%C02。
[0016] 本发明的另一目的是提供一种人工合成线粒体。
[0017] 具体技术方案如下：
[0018] 一种人工合成线粒体，其是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体空壳中得到 的。
[0019] 本发明还提供上述人工合成线粒体的制备方法。
[0020] 人工合成线粒体的制备方法，包括W下步骤：
[00川 （1)得到外源DNA;
[0022] (2)制备到线粒体空壳或分离到的线粒体；
[0023] (3)将步骤（1)所得的外源DNA电击转化导入步骤（2)所述线粒体空壳或分离到 的线粒体中，即得人工合成线粒体。
[0024] 在其中一个实施例中，所述外源DNA为分离得到的野生型DNA ;或所述外源DNA是 人工合成线粒体DNA，所述人工合成线粒体DNA制备包括W下步骤：
[00巧](1)在哺乳动物线粒体DNA序列的基础上，通过基因导入、基因敲除、定点突变、基 因重排中的至少一种基因改造方式，设计新的DNA序列组成；或得到野生型DNA序列组成；
[0026] (2)根据DNA序列的组成，合成50bp~60bp的DNA片段，通过Gibson等温一步法 拼接而成，获得人工合成线粒体DNA。
[0027] 本发明的另一目的是提供一种外源线粒体导入到细胞中的方法。
[0028] 实现该目的的技术方案如下：
[0029] -种外源线粒体导入到哺乳动物细胞中的方法，包括W下步骤：
[0030] (1)得到外源线粒体，
[0031] (2)将步骤（1)所得的外源线粒体加入到培养有内吞作用的哺乳动物细胞的细胞 培养体系中，继续培养，得到含有外源线粒体的细胞。
[0032] 在其中一个实施例中，所述外源线粒体是分离得到的哺乳动物细胞的线粒体。
[0033] 在其中一个实施例中，所述外源线粒体是通过将外源DNA导入到线粒体或线粒体 空壳中得到的人工合成线粒体。
[0034] 在其中一个实施例中，所述外源DNA是分离得到的野生型DNA。
[00巧]在其中一个实施例中，所述外源DNA是人工合成线粒体DNA，所述人工合成线粒体 DNA制备包括W下步骤：
[0036] (1)在哺乳动物线粒体DNA序列的基础上，通过基因导入、基因敲除、定点突变、和 基因重排中的至少一种基因改造方式，设计新的DNA序列组成；或得到野生型DNA序列组 成；
[0037] (2)根据DNA序列的组成，合成50bp~60bp的DNA片段，通过Gibson等温一步法 拼接而成，获得人工合成线粒体DNA。
[0038] 在其中一个实施例中，所述哺乳动物细胞是巨瞻细胞。
[0039] 在其中一个实施例中，所述培养条件；36-38 °C，水饱和密闭培养箱，4. 5-5. 5%0)2。
[0040] 本发明利用合成生物学技术，人工合成线粒体DNA全序列，在野生型序列基础上 实现了 GFP与C0X-I的融合表达，该为线粒体基因组分子克隆提供了简单有效的技术方法。 我们成功首次开发出基于巨瞻细胞内吞作用的将外源线粒体DNA导入细胞内的方法，获得 了