一种以Cfr蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测Cfr蛋白中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种W C化蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测C化蛋白中的 应用。
【背景技术】
[0002] C化基因首次由Stefan Schwarz教授在2000年从呼吸道感染的小牛鼻腔拭子 中分离的松鼠葡萄球菌中发现。敏感性实验表明该菌对四环素、红霉素、卡那霉素、氯霉素 和氣苯尼考均具有耐药性。通过质粒抽提、质粒转化实验和抗生素敏感性测定发现一个介 导多药耐药的质粒pSCFSl。该质粒大小为17. 1-化，除了包含介导红霉素耐药的ermC基 因外，还发现了一个能够介导对氯霉素（64 y g/mL)和氣苯尼考（32 y g/血）的耐药性的蛋 白质，即为C化蛋白（由349个氨基酸残基组成）。C化即化loramphenico^florfenicol resistance 的缩写。
[0003] 进一步的研究表明，C化基因编码的C化蛋白为一种rRNA甲基转移酶，它不同于其 它已知类型的rRNA甲基转移酶，但是和自由基SAM超家族中作用于蛋白自由基形成、异构 化和异常甲基化等功能的酶类相似。C化蛋白的作用位点是多种药物作用的祀位点A2503。 由于葡萄球菌23S rRNA中氯霉素类药物结合位点和林可霉素药物结合位点部分重叠，而且 A2503位的甲基化使23S rRNA中上述两类药物的结合位点构型发生变化，因而导致了葡萄 球菌对氯霉素类和林可霉素的耐药。截断侧耳素、恶哇焼丽类和链阳菌素A类药物作用于 革兰氏阳性菌中23S rRNA转肤中也，该转肤中也和A2503位临近，因此A2503位的甲基化还 可W介导该H类药物的耐药。深入进行对A2503位的甲基化介导的耐药机制研究后发现， C化蛋白催化该腺巧第8位的甲基化后而导致了细菌对醜胺醇类、林可胺类、恶哇焼丽类、 截断侧耳类和链阳菌素A类W及部分十六元环大环内醋类药物的耐药性。
[0004] 上述各类药物中既包含动物专用抗菌药物(氣苯尼考、泰妙菌素、沃尼妙林)，也有 人临床专用的抗菌药物(唾奴普汀/达福普汀)，甚至还包括2000年获得美国FDA批准的人 工合成的恶哇焼丽类抗生素-利奈哇胺，该药被认为是临床上治疗耐甲氧西林的金黄色葡 萄球菌(MRSA)和耐万古霉素的肠球菌（VRE)最后一道防线的药物。
[0005] 因此C化基因介导病原菌的耐药性是近年来耐药性领域的研究热点之一，具有很 重要的公共卫生意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种W C化蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测C化 蛋白中的应用。
[0007] 本发明提供了 C化蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株C化-D9 (简称杂交瘤细胞 C化-D9)，该杂交瘤细胞已于2013年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中也（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 8415。
[0008] 本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr-D9分泌的单克隆抗体。
[0009] 本发明还保护所述杂交瘤细胞C化-D9或所述单克隆抗体在制备与C化蛋白结合 的试剂盒中的应用。
[0010] 本发明还保护所述杂交瘤细胞C化-D9或所述单克隆抗体在制备辅助检测C化蛋 白的试剂盒中的应用。
[0011] 本发明还保护所述杂交瘤细胞C化-D9或所述单克隆抗体在辅助检测C化蛋白中 的应用。
[0012] 本发明还保护所述杂交瘤细胞C化-D9或所述单克隆抗体在制备辅助检测含有 Cfr蛋白的编码基因的菌的试剂盒中的应用。
[0013] 本发明还保护所述杂交瘤细胞C化-D9或所述单克隆抗体在辅助检测含有C化蛋 白的编码基因的菌中的应用。
[0014] W上任一所述的C化蛋白具体可如序列表的序列1所示。
[0015] 本发明提供的杂交瘤细胞可W分泌得到相应的单克隆抗体。本发明提供的单克隆 抗体可W结合并识别C化蛋白，具有良好的特异性和较高的效价。由于C化蛋白介导病原 菌的对多种药物的耐药性，本发明具有良好的推广价值。
【附图说明】
[001引 图1为Western Blot的结果图谱。
【具体实施方式】
[0017] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置H次重复实验，结果取平 均值。载体祀T-28a(+);购自Novagen公司，产品目录号为69864-3。大肠杆菌化21 0E3); 购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD601-01。本实施例中的PBS缓冲液，女口 无特殊说明，均为抑7. 4、0. 01M的PBS缓冲液。C化蛋白如序列表的序列1所示，C化基因 如序列表的序列2所示。
[001引实施例1、制备C化蛋白
[0019] 一、制备重组质粒
[0020] 1、合成序列表的序列2所示的双链DM分子。
[002。 2、W步骤2合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩 增，得到PCR扩增产物。
[0022] F1 ;5, -GGAATTCCATATG ATGAATTTTMTAATAAAAC-3，；
[0023] R1 ;5, -CGGAATTC CTATTGGCTATTTTGATAAT-3，。
[0024] 3、用限制性内切酶Nde I和EcoR I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。 [00巧]4、用限制性内切酶Nde I和EcoR I双酶切载体祀T-28a(+)，回收约5369bp的载 体骨架。
[0026] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒祀T-28a-c化。
[0027] 二、制备Cfr蛋白
[0028] 1、将重组质粒祀T-28a-c化导入大肠杆菌化21 0E3)，得到重组菌。
[0029] 2、将重组菌的单克隆接种至LB液体培养基，37°C、200r/min振荡培养过夜；
[0030] 3、取步骤2得到的菌液，W 1 ;100的体积比接种至LB液体培养基，37°C、200r/min 振荡培养至〇Dew?=〇. 8(实际操作中0. 6-1. 0均可);加入IPTG并使其浓度为1mmol/L，37C、 20化/min振荡培养化。
[0031] 4、完成步骤3后，取整个培养体系、4°C、900化pm离也lOmin，收集菌体沉淀，用 PBS缓冲液洗涂3次；用PBS缓冲液重息菌体，加入溶菌酶(购自SIGMA公司，产品目录号 为L6876)并使其浓度为lmg/ml，37°C静置30min，然后在冰上进行超声破碎（sonics and materials inc ;M0DE:VCX105 ;SERIAL N0:45852L ;40% 功率，每超声 2s 停 3s，总时间为 30min),然后4°C、9000巧m离也lOmin,收集沉淀。
[0032] 5、取步骤4得到的沉淀，用8mol/L尿素水溶液溶解，然后在冰上进行超声破碎 (sonics and materials inc ;M0DE:VCX105 ;SERIAL N0:45852L;40%功率，每超声2s停3s, 总时间为lOmin)，然后4°C、9000巧m离也lOmin，取上清液。
[0033] 6、取步骤5得到的上清液，进行12%聚丙帰醜胺凝胶电泳，切胶回收目的条带（即 分子量为39. 86kDa的条带)，加入PBS缓冲液并反复冻融W促使目的蛋白与凝胶充分分离， 然后4°C、900化pm离也lOmin，收集上清液，即为C化蛋白液。
[0034] C化蛋白液中的C化蛋白浓度队总蛋白浓度计，用PBS缓冲液调整总蛋白浓度。 [00巧]实施例2、杂交瘤细胞的获得
[0036] W实施例1制备的C化蛋白液免疫BALB/c小鼠；初次免疫时将弗氏完全佐剂与抗 原400U l(50-100y g均可）等体积混合，充分乳化，皮下分点注射；一个月后对小鼠进行加 强免疫，抗原量、注射体积和注射方式均不变，但改用弗