氏不完全佐剂；此后每间隔2周加 强免疫一次，共4次加强免疫；末次免疫7天后收集血清，取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细 胞融合，用HAT培养基进行选择性培养（W小鼠腹腔巨瞻细胞为滋养细胞)。
[0037] 用间接化ISA法检测杂交瘤细胞的培养上清，步骤如下；（1) W实施例1制备的 C化蛋白液(蛋白浓度为ly g/ml)包被酶标板，每孔lOOy l，37°C、2h ;(2)37°C封闭化，然 后每孔加入待检培养上清100 y 1，37°C赔育比，洗涂4次；（3)加酶标二抗(辣根过氧化物 酶标记的羊抗鼠IgG)，37C赔育比，洗涂4次；（4)每孔加100 y 1底物显色剂，室温避光静 止lOmin ;(5)每孔加终止液50y 1，用酶标仪测定波长450nm值，0D值高于阴性值2倍+3 倍标准差可视为阳性值。
[0038] 将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养(有限稀释法，W小鼠腹腔巨瞻细胞为滋养 细胞)。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将杂 交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存保种。
[0039] -株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体的效价最高，将该株杂交瘤细胞命名为 C化-D9。该杂交瘤细胞已于2013年10月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中也(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No. 8415。
[0040] 实施例3、单克隆抗体的制备、鉴定和应用
[0041] 一、单克隆抗体的制备和纯化
[004引 1、增量培养法
[0043] 细胞培养基（7. 4)的制备方法；向DMEM高糖培养基中添加小牛血清和碳酸氨轴， 小牛血清的终浓度为20% (质量百分含量)，碳酸氨轴的终浓度为0.2% (质量百分含量)。
[0044] 将杂交瘤细胞C化-D9置于细胞培养基中，37C培养2天，用辛酸-饱和硫酸馈法 将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体溶液（-2CTC保存)。
[004引单克隆抗体中的蛋白质浓度（mg/ml) =1. 45XOD28cT0. 74X0D2e。。
[0046] 采用W上公式计算单克隆抗体中的蛋白质浓度，为16. 5mg/ml。
[0047] 2、腹水制备
[0048] Ba化/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油（0. 4mL/只）。7天后腹腔注射杂交瘤细胞C化-D9 (5X 1〇5个/只）。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸馈法进行纯化，纯化后的腹水-2(TC 保存。
[0049] 二、单克隆抗体的鉴定
[0050] 将步骤一的1得到的单克隆抗体溶液分别进行如下鉴定：
[0051] 1、采用ELISA单克隆抗体亚型检测试剂盒（Sigma公司产品，产品目录号为19285) 检测单克隆抗体的亚型，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类为IgG2a。
[0052] 2、单克隆抗体的效价
[0053] (1)用PBS缓冲液将单克隆抗体溶液稀释至1000倍体积、3000倍体积、9000倍体 积、27000倍体积、81000倍体积、243000倍体系或729000倍体积。
[0054] (2)采用实施例1制备的C化蛋白液頌白浓度为1 y g/ml)包被酶标板，100 y L/ 孔，37 °C赔育化。
[00巧](3)取完成步骤（2)的酶标板，37C封闭2h，洗板。
[0056] (4)取完成步骤（3)的酶标板，每孔加入lOOy 1步骤（1)得到的单克隆抗体稀释 液(每种稀释液设置5个复孔)，37C赔育比，洗板；同时设置5个孔，用等体积PBS缓冲液 代替单克隆抗体稀释液，作为阴性对照。
[0057] (5)取完成步骤（4)的酶标板，加酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)， 37C赔育比，洗板。
[005引（6)取完成步骤（5)的酶标板，每孔加入100 y 1底物显色剂，室温避光静置lOmin， 然后每孔加入50 y 1终止液。
[0059] (7)取完成步骤（6)的酶标板，用酶标仪测定波长450nm值。
[0060] 将阔值设为；2X阴性对照孔的平均值0D值+3倍标准差。对于试验孔来说，如果 其0D值高于阔值，即可判断为阳性。
[0061] 单克隆抗体溶液的效价为1 ;243000。
[0062] 3、单克隆抗体的特异性
[0063] 1株C化阳性菌和1株C化阴性菌均从野外分离获得，经鉴定均为大肠杆菌。形态 鉴定的结果描述如下：革兰染色呈阴性，镜下形态为红色短小的杆状。经PCR鉴定(上游引 物；CGATTTGAGGATATGAAGGTTCT ;下游引物：AAATTAGGATCCGTAAACGAAT)，cfr 阳性菌基因组 中含有C化基因，C化阴性菌基因组中不含有C化基因。
[0064] (1)用PBS缓冲液重息C化阳性菌或C化阴性菌，得到0Dew">=0. 8的菌息液。
[0065] (2)取步骤（1)得到的菌息液，加入溶菌酶至浓度为10mg/ml、TritonX-100至浓度 为1% (体积比)、蛋白酶抑制剂PMSF至浓度为lOOy g/mL，冰浴静置比，然后在冰上进行超 声破碎（sonics and materials inc ;M孤E ;VCX105 ;SERIAL NO ;45852L ;40% 功率，每超声 2s停3s，总时间为30min)，然后4°C、9000巧m离也lOmin，收集沉淀。
[0066] (3)取步骤（2)得到的沉淀，用8mol/L尿素水溶液溶解，然后在冰上进行超声破 碎（sonics and materials inc ;M孤E ;VCX105 ;SERIAL NO ;45852L ;40%功率，每超声 2s 停 3s，总时间为lOmin)，然后4°C、9000巧m离也lOmin，取上清液。
[0067] (4)取步骤（3)得到的上清液，进行12%聚丙帰醜胺凝胶电泳，然后转至硝酸纤维 膜进行western blot,采用的一抗为步骤一的1得到的单克隆抗体溶液的2000倍稀释液 (采用PBS缓冲液稀释)，采用的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG的10000倍稀释 液。结果见图1(1 ;c化阴性菌；2 ;c化阳性菌)。结果显示，单克隆抗体可W特异性地结合 并识别自然菌中的C化蛋白，在约40kDa处有特异性的反应条带。
【主权项】
1. Cfr蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株Cfr-D9,它的保藏编号为CGMCC No. 8415。
2. 权利要求1所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
3. 权利要求2所述单克隆抗体或权利要求1所述杂交瘤细胞在制备与Cfr蛋白结合的 试剂盒中的应用。
4. 权利要求2所述单克隆抗体或权利要求1所述杂交瘤细胞在制备辅助检测Cfr蛋白 的试剂盒中的应用。
5. 权利要求2所述单克隆抗体或权利要求1所述杂交瘤细胞在辅助检测Cfr蛋白中的 应用。
6. 权利要求2所述单克隆抗体或权利要求1所述杂交瘤细胞在制备辅助检测含有Cfr 蛋白的编码基因的菌的试剂盒中的应用。
7. 权利要求2所述单克隆抗体或权利要求1所述杂交瘤细胞在辅助检测含有Cfr蛋白 的编码基因的菌中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种以Cfr蛋白为免疫原得到的单克隆抗体及其在检测Cfr蛋白中的应用。本发明提供了杂交瘤细胞Cfr-D9，保藏号为CGMCC No.8415。本发明还保护所述杂交瘤细胞Cfr-D9分泌的单克隆抗体。本发明提供的单克隆抗体可以结合并识别Cfr蛋白，具有良好的特异性和较高的效价。由于Cfr蛋白介导病原菌的对多种药物的耐药性，本发明具有良好的推广价值。CGMCC No841520131030
【IPC分类】C12N5-20, G01N33-577, G01N33-68, G01N33-569, C07K16-12
【公开号】CN104630150
【申请号】CN201310572041
【发明人】吴聪明, 沈建忠, 汪洋, 钟洁, 陈乐然
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年11月13日