血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5% ;
[0048] S3.驯化细胞适应低血清培养环境：
[0049] 使用T75细胞瓶，37C静态培养驯化的第四代ST细胞，培养液为默克MD低血清培 养基和血清的混合液，血清的含量为1~5%，即为生产用种子细胞；
[0050] S4.细胞毒种的繁殖：
[0051] 用病毒培养液将猪癌C株病毒种毒按0. 5~1 % (v/v)的比例接种到生产用种 子细胞单层中进行培养，培养7化后收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行 细胞适应性连续传代，直至TCIDg。稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；病毒毒种培养液 为DMEM、5%的血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0. 5%，抗生素的含量为100~ 200IU/mL，且混合液的抑值为7. 2~7. 4 ;
[0052] S5.制备毒液的繁殖：
[0053] 待生产用种子细胞形成单层，按0.5~1% (v/v)的比例接入生产用种毒，置于 培养温度为37°C、5 %的二氧化碳培养箱中培养，接种后72h收获病毒，病毒毒种培养液 为DMEM、5%的血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0. 5%，抗生素的含量为100~ 200IU/mL，且混合液的抑值为7. 2~7. 4。
[0054] 收获病毒液的处理；收获的病毒液经过两到H次冻融后，离也或过滤除去细胞碎 片后置于-70°C保存备用。
[00巧]实施例2 ;低血清培养ST细胞生产猪癌C株病毒的方法，它包括W下步骤：
[005引 S1.巧[J备用细胞的传代与培养：
[0057] 取T75瓶培养铺满单层ST细胞，经邸TA-膜酶细胞分散液消化细胞，邸TA-膜酶 细胞分散液为质量分数为0. 15%的膜酶和0. 02%的邸TA的Hank'S液的混合液，用细胞生 长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将ST细胞置于温度为37 +2°C的二氧化碳培养 箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10%血清含量 的MEM培养液；
[0058] S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括W下子步骤：
[0059] S21.第一代细胞的驯化：
[0060] 将步骤S1扩大培养的ST细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一 代低血清培养基为含10%血清的MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合 液，MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8. 3% ;
[0061] S22.第二代细胞的驯化：
[0062] 将驯化的第一代ST细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低 血清培养基为含10%血清的MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液， MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1: 1，其中血清的含量为7. 5% ;
[0063] S23.第H代细胞的驯化：
[0064] 将驯化的第二代ST细胞接种到第H代低血清培养基中进行驯化，所述第H代低 血清培养基为含10%血清的MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液， MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2,其中血清的含量为6. 7% ;
[0065] S24.第四代细胞的驯化：
[0066] 将驯化的第H代ST细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低 血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5% ;
[0067] S3.驯化细胞适应低血清培养环境：
[0068] 使用T75细胞瓶，37C静态培养驯化的第四代ST细胞，培养液为默克MD低血清培 养基和血清的混合液，血清的含量为1~5%，即为生产用种子细胞；
[0069] S4.细胞毒种的繁殖：
[0070] 用病毒培养液将猪癌C株病毒种毒按0. 5~1 % (v/v)的比例接种到生产用种 子细胞单层中进行培养，培养7化后收获毒液；将此毒液作为种毒，在生产用细胞上进行细 胞适应性连续传代，直至TCIDg。稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；病毒毒种培养液 为MEM、5%的血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0. 5%，抗生素的含量为100~ 200IU/mL，且混合液的抑值为7. 2~7. 4 ;
[0071] S5.制备毒液的繁殖：
[0072] 待生产用种子细胞形成单层，按0.5~1% (v/v)的比例接入生产用种毒，置于 培养温度为37°C、5 %的二氧化碳培养箱中培养，接种后72h收获病毒；病毒毒种培养液 为MEM、5%的血清和抗生素的混合液，其中，血清的含量为0. 5%，抗生素的含量为100~ 200IU/mL，且混合液的抑值为7. 2~7. 4。
[0073] 收获病毒液的处理；收获的病毒液经过两到H次冻融后，离也或过滤除去细胞碎 片后置于-7〇°C保存备用。
[0074] 实施例3 ;低血清培养基驯化ST细胞效果
[00巧]使用T75细胞瓶，37C静态培养适应低血清培养基第四代ST细胞，血清添加比例 为1%，2%，3%，4%，5%五个梯度，并设立使用血清含量为10%的0161液培养的51'细胞 为对照组，结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示，细胞培养过程中各指标见表1。（默 克MD系列干粉低血清培养基包括DMEM和MEM)
[0076] 表1 ;MD系列低血清培养基驯化ST细胞效果
[0077]
【主权项】
1. 低血清培养ST细胞生产猪瘟C株病毒的方法，其特征在于，它包括以下步骤：
51. 制备用细胞的传代与培养： 取T75瓶培养铺满单层ST细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化细胞，用细胞生长液吹 打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将ST细胞置于温度为37±2°C的二氧化碳培养箱中培 养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10%血清含量的DMEM 或MEM培养液；
52. 驯化细胞适应低血清培养基：包括以下子步骤：
521. 第一代细胞的驯化： 将步骤Sl扩大培养的ST细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第一代低 血清培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混 合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8. 3% ;
522. 第二代细胞的驯化： 将驯化的第一代ST细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代低血清 培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液， DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为7. 5% ;
523. 第三代细胞的驯化： 将驯化的第二代ST细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述第三代低血清 培养基为含10%血清的DMEM或MEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合液， DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2,其中血清的含量为6. 7% ;
524. 第四代细胞的驯化： 将驯化的第三代ST细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代低血清 培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5% ;
53. 驯化细胞适应低血清培养环境： 使用T75细胞瓶，37°C静态培养驯化的第四代ST细胞，培养液为默克MD低血清培养基 和血清的混合液,血清的含量为1~5%，即为生产用种子细胞；
54. 细胞毒种的繁殖： 用病毒培养液将猪瘟C株病毒种毒按0. 5~1% (v/v)的比例接种到生产用种子细胞 单层中进行培养，培养72h后收获毒液；将此毒液作为种毒,在生产用细胞上进行细胞适应 性连续传代，直至TCID5tl稳定，此时收获的毒液作为生产用种毒；
55. 制备毒液的繁殖： 待生产用种子细胞形成单层，按0. 5~1% (v/v)的比例接入生产用种毒，置于培养温 度为37°C、5%的二氧化碳培养箱中培养，接种后72h收获病毒。
2. 如权利要求1所述的低血清培养ST细胞生产猪瘟C株病毒的方法，其特征在于，所 述EDTA-胰酶细胞分散液为质量分数为0. 10~0. 25%的胰酶和0. 02%的EDTA的Hank' s 液的混合液。
3. 如权利要求1所述的低血清培养ST细胞生产猪瘟C株病毒的方法，其特征在于，步 骤Sl中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中血清的含量为1~5%。
4. 如权利要求1所述的低血清培养ST细胞生产猪瘟C株病毒的方法，其特征在于，步 骤S4和S5中所述的病毒毒种培养液为低血清培养基、血清和抗生素的混合液，其中，血清 的含量为O~1%，抗菌素的含量为100~200IU/mL，且混合液的pH值为7. 2~7. 4。
【专利摘要】本发明公开了低血清培养ST细胞生产猪瘟C株病毒的方法，属于兽医生物学技术领域，它包括以下步骤：S1.制备用细胞的传代与培养；S2.驯化细胞适应低血清培养基；S3.驯化细胞适应低血清培养环境；S4.细胞毒种的繁殖；S5.制备毒液的繁殖。本发明提供的低血清培养ST细胞生产猪瘟C株病毒的方法，可以显著降低生产成本，同时可以提高下游纯化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
【IPC分类】C12N7-00, C12N5-071, C12R1-93
【公开号】CN104630159
【申请号】CN201510098541
【发明人】徐宏军, 胡来根, 牟和平, 岳丰雄, 王洁清
【申请人】成都天邦生物制品有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年3月5日