低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医生物学技术领域，具体涉及低血清培养vero细胞生产猪流行性 腹泻CV777株病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 2010年下半年W来，猪流行性腹泻病又在我国出现新一轮的爆发流行。最早发生 在广西，然后湖南、华北、华东、山东、河北等地普遍发病，呈现全国性大流行，造成哺乳猪仔 的大量死亡，据农业部流行病学中也统计，2011年猪流行性腹泻（阳D)病引起猪的死亡数 已占据所有我国现有猪病的首位。
[0003] 目前，国内猪流行性腹泻疫苗生产技术不论是传统的转瓶培养技术，还是先进的 生物反应器息浮培养技术，均采用高血清含量细胞培养技术。该传统工艺效率低、生产成本 高；不同血清批次间差异显著；放大重现性较差；对下游纯化工艺要求高；容易出现血清出 复杂成分导致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。另外，目前全球血清供应趋 紧，该大大影响了疫苗企业的生产效率。因此低血清培养技术的应用势在必行。经检索，未 有关于低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的相关文献报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供低血清培养Vero细胞生产猪流行 性腹泻CV777株病毒的方法，该方法可W显著降低生产成本，同时可W提高下游纯化的效 率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
[0005] 本发明的目的通过W下技术方案来实现；低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹 泻CV777株病毒的方法，它包括W下步骤：
[000引 S1.巧[J备用细胞的传代与培养：
[0007] 取T75瓶培养铺满单层Vero细胞，经邸TA-膜酶细胞分散液消化细胞，用细胞生 长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Vero细胞置于温度为37 +2°C的二氧化碳培 养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10%血清含 量的DMEM或MHM培养液；
[0008] S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括W下子步骤：
[0009] S21.第一代细胞的驯化：
[0010] 将步骤S1扩大培养的Vero细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第 一代低血清培养基为含10 %血清的DMEM或MEM培养液和含5 %血清的默克MD低血清培养 液的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为 8. 3% ；
[0011] S22.第二代细胞的驯化：
[0012] 将驯化的第一代Vero细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代 低血清培养基为含10 %血清的DMEM或MEM培养液和含5 %血清的默克MD低血清培养液 的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:1，其中血清的含量为 7. 5% ；
[0013] S23.第H代细胞的驯化：
[0014] 将驯化的第二代Vero细胞接种到第H代低血清培养基中进行驯化，所述第H代 低血清培养基为含10 %血清的DMEM或MEM培养液和含5 %血清的默克MD低血清培养液 的混合液，DMEM或MEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2,其中血清的含量为 6. 7% ；
[0015] S24.第四代细胞的驯化：
[0016] 将驯化的第H代Vero细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代 低血清培养基为默克MD低血清培养基和血清的混合液，血清的含量为5% ;
[0017] S3.驯化细胞适应低血清培养环境：
[0018] 使用T75细胞瓶，37C静态培养驯化的第四代Vero细胞，培养液为默克MD低血清 培养基和血清的混合液，血清的含量为1~5%，即为生产用种子细胞；
[0019] S4.细胞毒种的繁殖：
[0020] 用病毒培养液将猪流行性腹泻CV777株病毒毒种按1~5% (v/v)的比例接种到 生产用种子细胞单层中进行培养，至细胞70%发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒， 在生产用细胞上进行细胞适应性连续传代，直至TCIDg。稳定，此时收获的毒液作为生产用 种毒；
[0021] S5.制备毒液的繁殖：
[0022] 待生产用种子细胞形成单层，按1~5% (v/v)的比例接入生产用种毒，置于培养 温度为37 +2°C的二氧化碳培养箱中培养，待70% W上细胞发生病变时收获病毒液。
[0023] 进一步地，所述邸TA-膜酶细胞分散液为质量分数为0. 10~0. 25 %的膜酶和 0. 02%的邸TA的Hank' S液的混合液。
[0024] 进一步地，步骤S1中所述细胞生长液为低血清培养基和血清的混合液，其中血清 的含量为1~5%。
[00巧]进一步地，步骤S4和S5中所述的病毒毒种培养液为低血清培养基、血清和抗生素 的混合液，其中，血清的含量为0~1%，抗菌素的含量为100~200IU/mL，且混合液的抑 值为7. 2~7.4。
[0026] 上述技术方案中，低血清培养基为默克MD系列干粉低血清培养基，培养基在使用 前，需按照说明书配成溶液，具体方法如下：1)将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注 射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温2(TC~3(TC)到17. 5升，轻 微揽拌溶解；2)加入23克碳酸氨轴；3)轻微揽拌溶解，加注射用水至20升；4)如果必要， 用Imol/L氨氧化轴溶液或Imol/L盐酸溶液调抑至7. 2-7. 4 ;5)用0. 2 y m滤膜正压过滤 除菌；6)溶液应在2C -8C下避光保存。
[0027] 本发明具有W下优点：本发明低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病 毒生产疫苗中使用低血清培养基可有效降低培养液中的牛血清使用量，并能提高细胞密度 及生物制品的产率；本发明Vero细胞在低血清培养基的生长情况甚至优于加入10%牛血 清的传统培养基，且能提高细胞密度、提高病毒滴度，获取同样的细胞量，用低血清培养基 将比用传统培养基缩短近1/3的时间，可提高生产效率。因此，本发明提供低血清培养Vero 细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法可W显著降低生产成本，同时可W提高下游纯 化的效率，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
【附图说明】
[002引图1为实施例3中血清添加比例为1%时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培 养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[002引图2为实施例3中血清添加比例为2%时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培 养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[0030] 图3为实施例3中血清添加比例为3%时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培 养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[003。 图4为实施例3中血清添加比例为4%时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培 养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[003引图5为实施例3中血清添加比例为5%时Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培 养时间为2化，图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[003引图6为实施例3中对照组Vero细胞的生长效果图，其中，图a的培养时间为2化， 图b的培养时间为4她，图C的培养时间为72h ;
[0034] 图7为实施例4中低血清培养液驯化的Vero细胞接种猪癌病毒后病变情况，其 中，图a的血清添加比例为1 %，图b的血清添加比例为2%，图C的血清添加比例为3%，图 d的血清添加比例为4%，图e的血清添加比例为5%，图f为对照组。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于W下所 述。
[0036] 实施例1 ;低血清培养Vero细胞生产猪流行性腹泻CV777株病毒的方法，它包括 W下步骤：S1.制备用细胞的传代与培养：
[0037] 取T75瓶培养铺满单层Vero细胞，经邸TA-膜酶细胞分散液消化细胞，邸TA-膜 酶细胞分散液为质量分数为0. 15%的膜酶和0. 02%的邸TA的Hank' S液的混合液；用细 胞生长液吹打分散细胞，加入20ml细胞生长液，将Vero细胞置于温度为37 +2°C的二氧化 碳培养箱中培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行放大培养，上述细胞生长液为10%血 清含量的DMEM培养液；
[0038] S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括W下子步骤：
[0039] S21.第一代细胞的驯化：
[0040] 将步骤S1扩大培养的Vero细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述第 一代低血清培养基为含10%血清的DMEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混 合液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为2:1，其中血清的含量为8. 3% ;
[0041] S22.第二代细胞的驯化：
[0042] 将驯化的第一代Vero细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述第二代 低血清培养基为含10%血清的DMEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合 液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1: 1，其中血清的含量为7. 5% ;
[0043] S23.第H代细胞的驯化：
[0044] 将驯化的第二代Vero细胞接种到第H代低血清培养基中进行驯化，所述第H代 低血清培养基为含10%血清的DMEM培养液和含5%血清的默克MD低血清培养液的混合 液，DMEM培养液与默克MD低血清培养液体积比为1:2,其中血清的含量为6. 7% ;
[0045] S24.第四代细胞的驯化：
[0046] 将驯化的第H代Vero细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述第四代 低血清培养基为默克MD低血清培养