在酵母表达系统中利用人内质网分子伴侣蛋白天然信号序列产生天然重组的分泌的人内 ...的制作方法
【专利说明】在酵母表达系统中利用人内质网分子伴侣蛋白天然信号序 列产生天然重组的分泌的人内质网分子伴侣蛋白
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2012年7月12日递交的共同未决美国临时申请61/670, 768号的 权益，特此通过引用将其整体并入本文。
【背景技术】
[0003] 内质网巧时分子伴侣蛋白是多功能蛋白，参与多种生物学过程如蛋白折叠和 邸中的质量控制化ebe;rt等，1995 ;化ang等，1997 ;E5raakman&vanAnken，2000 ;Hi曲等， 2000;Bedard等，2005;Benyair等，2011 ;化aakman&Bulleid，2011)、解折叠蛋白反应 (Spear&Ng，2001 ;Ma&胎ndershot，2004 ;Malhotra&Kaufman，2007;Groenendyk等，2010 ; Chakr油arti等，2011)，I类M肥抗原加工（Maffei等，1997 ;Nicchitta&Reed，2000 ; 化ang&Williams，2006 ;Wearsch&Cresswell，2009)W及该些蛋白在邸外侧行使的其他重 要功能（Panayi&Corrigall，2006 ;Gonzalez-Gronow等 2009;Gold等，2010;Ni等，2011 ; 化ters紐a曲avan，2011 ;Turano等，2011)。邸分子伴侣蛋白在各种人疾病中的作用可能 尤为重要。表明特定邸分子伴侣蛋白参与多种病理过程的数据量日益增多。例如，邸分 子伴侣蛋白GRP78/BiP可能参与癌症进展（Li化ee，2006 ;Lee，2007 ;Luo化ee，2012)、自身 免疫炎症和组织损伤（Panayi&Corrigall，2006 ;Morito&Nagata，2012)和风湿性关节炎 (Corrigall等，2001;Yoo等，2012)。另一ER分子伴侣蛋白巧网蛋白（calreticulin)在 激活化疗和各种其他癌症治疗策略所需的抗肿瘤响应中具有重要作用（化aput等，2007 ; 化eid等，2007 ;Wemeau等，2010)并且还与皮肤创伤的愈合过程相关（Nann巧等，2008)。其 他邸分子伴侣蛋白也设及了疾病相关过程，例如，对于分子伴侣蛋白GRP58/E化57而言是 航病毒疾病Ofetz等，2005)。该些最近的发现表明可将邸分子伴侣蛋白应用于治疗试验 和新药开发。因此，可预见不久的将来对人ER分子伴侣蛋白产品会有增长的需求。
[0004] 天然人邸分子伴侣蛋白可W从各种组织中纯化，例如已经从人胎盘中纯化了巧 网蛋白化ouen&Koch，1994)，但人组织对于大规模临床试验而言不是该些蛋白的充足来源。 为有效而安全地生产该些蛋白应考虑重组蛋白表达技术。另外，理想的是该些重组蛋白对 于临床试验应尽可能对应于天然类似物。
[0005] 当前大多数重组人邸分子伴侣蛋白在细菌宿主大肠杆菌中产生（Rokeach等， 1991 ;Baksh等，1992 ;Antoniou等，2002)，并且该些产品可商购获得（Abeam产品油78432， 油91577 和油92937, 2012 ;StressMarq产品SPR-119B，2012;USBiological产品B1770-01， C1036-02L1和E2291-75E，2012)。然而，大肠杆菌和其它原核生物不具有ER、Golgi器和 真核分泌途径的其它细胞器，因此不确定在细菌中产生的人ER蛋白是否正确折叠并具有 所有与天然蛋白类似物相同的功能。酵母是产生ER分子伴侣蛋白和其它复杂的分泌人蛋 白的有吸引力的宿主，因为该种单细胞真核微生物具有真核特征，包括导致正确蛋白加工 和翻译后修饰的分泌途径（Mattanovich等，2012)。已经进行多种尝试来在酵母中产生重 组分泌的人蛋白值amasceno等，2012出OU等，2012)，因为该种表达系统有利于蛋白产物的 纯化和下游加工，并且分泌的蛋白通常具有生物学活性。对于在酵母中产生分泌的人m?分 子伴侣蛋白，可W采用数种技术。所有该些方法都包括利用与经加工的成熟人m?蛋白的序 列融合的常规酵母蛋白分泌信号。W该种方式产生的蛋白产物在N末端具有数个非天然 氨基酸，该一操纵对所制备蛋白的生物学活性的影响是未知的。迄今为止文献描述的酵母 表达的分泌的全长重组哺乳动物邸分子伴侣蛋白的唯一已知实例是在毕赤酵母（Pichia pastoris)中产生的重组兔巧网蛋白（An化in等，2000)。
【发明内容】
[0006] 已知尚未尝试利用人邸分子伴侣蛋白的天然信号序列在微生物宿主中产生与人 细胞中天然类似物相同的方式正确加工的最终天然重组ER分子伴侣蛋白产物。本文描述 了在酿酒酵母仅cerevisiae)和毕赤酵母（P.pastoris)表达系统中利用数种细胞内人邸 分子伴侣蛋白的天然信号序列从而将正确加工的终产物分泌到培养基。令人惊讶的是，该 方法能够产生大量的按照与人细胞中相同的方式加工的天然重组人分子伴侣，不同之处在 于成熟的蛋白产物被分泌到酵母培养基中。本发明还显示了证实人ER分子伴侣蛋白的信 号序列在酵母细胞中正确加工的实验数据，并提供了如何有效W分泌形式产生该些蛋白。
[0007] 本发明提供了通过简单的下游纯化程序在酵母中产生天然重组人邸分子伴侣蛋 白的方法。该些蛋白不具有任何附加的人工氨基酸序列，并且被加工成最终产物，根据其预 测分子量恰好对应于类似的人蛋白。该通过整合如下所述的数种关键因素而实现，并仅适 用于人内质网巧时管腔蛋白。通过种人ER蛋白为例描述程序，结果显示所述方法如 何进行。
[000引本发明涵盖了产生重组蛋白的方法。该些方法包括W下步骤
[0009] (a)W核巧酸序列转化酵母细胞，所述核巧酸序列包含针对天然人ER分子伴侣蛋 白信号序列和人ER分子伴侣蛋白的编码序列；
[0010] 化）在人m?重组分子伴侣蛋白W分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞；和 [ocm] (C)从培养基中提取所述人邸重组分子伴侣蛋白。
[0012] 本发明所述方法的一个实施方式产生人邸重组分子伴侣蛋白，其中所述人邸分 子伴侣蛋白是人邸管腔蛋白。该方法包括W下步骤：在W分泌形式表达人邸重组分子伴 侣蛋白的条件下培养酵母细胞，所述酵母细胞已转化有核巧酸序列，所述核巧酸序列包含 针对天然人ER分子伴侣蛋白信号序列和人ER分子伴侣蛋白两者的编码序列；和从培养基 中提取所述人m?重组分子伴侣蛋白。
[0013] 本发明所述方法的另一实施方式产生选自由BiP/GRP78、巧网蛋白和E化57组成 的组的人m?重组分子伴侣蛋白。所述方法包括W下步骤
[0014] (a)提供转化有核巧酸序列的酵母细胞，所述核巧酸序列包含针对天然人ER分子 伴侣蛋白信号序列和人ER分子伴侣蛋白两者的编码序列；
[0015] 化）在人m?重组分子伴侣蛋白W分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞；和
[0016] (C)从培养基中提取BiP/GRP78、巧网蛋白或E化57中的至少一种。
[0017] 本发明所述方法可产生高达约lOOmg/L的所需蛋白，并且通过本领域已知的常规 方法优化酵母培养条件可W进一步增加产量。
[0018] 本发明所述方法的另一实施方式通过W下步骤产生人m?重组分子伴侣蛋白，
[0019] (a)提供转化有核巧酸序列的酵母细胞，所述核巧酸序列包含针对天然人ER分子 伴侣蛋白信号序列和人ER分子伴侣蛋白两者的编码序列；
[0020] 化）在人m?重组分子伴侣蛋白W分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞；和
[0021] (C)从培养基中提取所述人邸重组分子伴侣蛋白。
【附图说明】
[0022] 图1显示了用空质粒转化（泳道1)或产生人分子伴侣BiP、巧网蛋白和E化57 (分 别为泳道2、3和4)的酿酒酵母A肥2细胞的40X浓缩的培养基的SDS-PAGE(图1A)和蛋 白质印迹（图1B)分析。
[0023] 图2