显示了从酿酒酵母纯化的分泌的重组人分子伴侣巧网蛋白（图2A)、 E化57(图 2B)和GRP78/BiP(图 2C)的ESI-MS。
[0024] 图3显示了来自所选择的过表达了分泌的重组人BiP(图3A)、巧网蛋白（图 3B)和E化57(图3C)的毕赤酵母GS115株多拷贝转化体的未浓缩的培养基（各8y1)的 SDS-PAGE。C表示对照（转化有不具有人基因的空载体PPIC3. 5K并与过表达人分子伴侣的 株平行培养的毕赤酵母GS115株的8y1未浓缩培养基），而M是具有条带上方所指示的已 知分子量的蛋白标记物。
[0025] 图4显示了从酿酒酵母培养基纯化分泌的重组人GRP78/BiP蛋白。泳道代表蛋白 分子量标记物（M)、人BiP在酿酒酵母中表达后的酵母培养基（A)、微孔过滤后相同酵母生 长培养基炬）、切向超离屯、后的相同培养基（C)和通过ATP亲和层析从相同培养基纯化的分 泌的重组人BiP蛋白值）。
[0026] 图5显示了利用MLDI-TOF/TOF串联MS/MS(质谱）W及UPLC/MSE法对酿酒酵母 分泌的GRP78/BiP蛋白条带的膜蛋白酶化肤质量指纹（massfinge巧rinting)的定位。
[0027] 图6分别显示了通过E血an降解和ESI-MS对酿酒酵母和毕赤酵母分泌的重组人 GRP78/BiP的完整分子的N端测序结果。
[002引图7显示了从酿酒酵母（图7A)和毕赤酵母（图7B)纯化的重组BiP蛋白的部分 蛋白水解。
[0029] 图8显示了利用细菌和酵母中表达的重组BiP蛋白进行的ATP酶活性测试。
[0030] 图9显示了从酿酒酵母纯化的重组人BiP蛋白的天然PAGE。
[0031] 图10显示了分别对酵母培养基W及来自毕赤酵母和酿酒酵母的纯化的重组人巧 网蛋白样品的SDS-PAGE分析。
[0032] 图11显示了酿酒酵母表达的蛋白的膜蛋白酶化肤质量指纹，该确认了纯化的分 泌蛋白代表了具有正确加工的N端氨基酸序列的人巧网蛋白。
[003引图12显示了从毕赤酵母和酿酒酵母纯化的分泌的重组人巧网蛋白的ESI-MS和N端Edman测序。
[0034] 图13显示了对从毕赤酵母培养基纯化的重组人巧网蛋白的膜蛋白酶消化证实了 酵母分泌的人蛋白的正确折叠。
[0035] 图14显示了关于源自细菌和酵母的重组巧网蛋白诱导的人成纤维细胞增殖的数 据。
[0036] 图15显示了伤口愈合刮擦平板测试的数据。源自细菌或酵母的重组巧网蛋白诱 导了人成纤维细胞迁移。
[0037] 图16显示了来自酵母培养基的分泌的重组人E化57蛋白的纯化。泳道代表蛋白 分子量标记物（M)、人E化57在酿酒酵母中表达后的粗酵母生长培养基（A)、微孔过滤后的 相同酵母生长培养基炬）、切向超离屯、后的相同培养基（C)和利用肝素Se地arose通过一步 亲和层析从相同培养基纯化的分泌的重组人E化57蛋白值）。
[003引 图17显示了从酿酒酵母纯化的分泌重组人邸p57的ESI-MS和N端Edman测序。
[0039] 图18显示了通过膜蛋白酶化肤质量指纹对从酿酒酵母纯化的分泌的重组人分子 伴侣E化57(PDIA3)进行的蛋白N端鉴定。
[0040] 图19显示了通过膜岛素沉降法测试的酵母来源的重组人E化57蛋白的硫醇基依 赖的催化活性。
[0041] 图20显示了从毕赤酵母纯化的分泌的重组人E化57的SDS-PAGE。
【具体实施方式】
[0042] 本发明涵盖了在酵母细胞中合成天然重组分泌的人邸分子伴侣蛋白的酵母表达 系统。酵母是能够对表达的多肤进行真核加工的单细胞真核微生物。由于酵母是真核生 物，因此其细胞内环境更适合包括人细胞蛋白的真核蛋白的正确折叠。酵母来源的异源蛋 白不含毒性污染物，是开发疫苗、诊断剂或生物医药的优异工具。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)被称为GRAS(-般认为是安全的）生物。酵母中产生的大多数天然重组人或 病毒蛋白具有与来自人细胞的天然蛋白相似的性质，优于其在细菌中表达的类似物。对各 种高质量重组蛋白的增长性需求需要更好和更有效的表达系统，甚至对于有充分建立的生 产规程的蛋白也是如此。用于各种目的的天然人蛋白通常从各种人细胞纯化，因为重组蛋 白利用各种标签从大肠杆菌中合成和纯化。本发明证明酵母是迄今用于表达和纯化天然重 组人蛋白的优异宿主。
[0043] 邸分子伴侣蛋白是多功能蛋白，参与多种生物学过程如蛋白折叠和邸中的质量 控制、解折叠蛋白响应、I类M肥抗原加工、W及该些蛋白在邸外侧行使的其他重要功能。 ER分子伴侣蛋白在各种人疾病中的作用可能尤为重要，有数据表明特定ER分子伴侣蛋白 参与多种病理过程。该些最近的发现表明可将ER分子伴侣蛋白应用于治疗试验和新药开 发，W及基础研究和应用研究。重组蛋白表达技术可W有效和安生地产生该些蛋白。此处 提供的实例包括包括但不限于在酵母细胞中产生的GRP78/BiP、巧网蛋白和GRP58/E化57。 通过本发明方法产生的所得蛋白不具有标签。没有标签用于纯化该些重组蛋白；然而，蛋白 也可W具有His标签。通过本发明方法产生的所得蛋白在酵母细胞中得到正确加工，最终 蛋白产物由与人细胞中相同的氨基酸序列组成。所得的重组产物中不存在非天然修饰。所 得的重组蛋白的寡聚状态对应于从人组织中分离的天然人分子伴侣蛋白的寡聚状态。本发 明方法产生的所得的重组蛋白具有完全的活性并且具有稳定性。
[0044] S种人ER蛋白用作所公开程序中的实例。从商用人肝脏cDNA文库（Clonetech， USA)中克隆了编码人邸分子伴侣蛋白BiP/GRP78(SEQIDN0:1)、巧网蛋白（SEQIDN0:2) 和E化57(SEQIDN0:3)的人基因服PA5(SEQIDN0:4)、CALR(SEQIDN0:5)和PDIA3(SEQ IDN0:6)(GeneBank编号分别为AF216292、M84739 和U42068)。对人基因的cDNA进行 无损克隆，不改变对信号序列、ER保留信号进行编码的序列。对蛋白的功能性部分没有 去除、修饰或w来自酵母或任何其他物种的基因的任何同源序列取代。核巧酸序列分析 后，人基因服PA5、CALR和PDIA3克隆到（Ciplys等，2011)所述的酵母PGK1基因启动子 控制的酵母表达载体P抑C中，得到3种重组质粒P抑C-BiP、P抑C-CALR和P抑C-E化57。 携带人基因的P抑C-BiP、P抑C-CALR和P抑C-E化57酵母表达载体用于转化酿酒酵母株 A肥2M/VTa(leu化is4)。酵母转化和后续对转化体的筛选完全按照（Ciplys等，2011)所述进 行。在YEPD培养基（酵母提取1%，蛋白腺2%，右旋葡萄糖2%)中培养携带重组质粒的 酵母细胞后，分析酵母细胞和生长培养基中的蛋白。令人惊讶的是，如图1所示，重组人分 子伴侣不仅如此前所述（Ciplys等，2011)存在于酵母细胞的膜蛋白部分中，还W相当大量 存在于培养基中，其构成培养基中所有蛋白的约50 %~60 %。
[0045] 约1L的培养基含有40mg~50mg的分泌的人巧网蛋白和lOmg~15mg的BiP/ GRP78和E化57蛋白。利用抗各人分子伴侣的特异抗体通过蛋白质印迹分析确认蛋白的身 份（图1B);泳道2-抗人BiP/GRP78的兔多克隆抗体（Ab21685,Abeam,UK);泳道3-抗人 巧网蛋白的小鼠单克隆抗体（Ab22683,Abeam,UK);和泳道4-抗人邸p57的小鼠单克隆抗 体（Abl3506，Abcam，UK)。所观察到的该一人邸分子伴侣蛋白在酵母中利用其不具有任何 改变的完整cDNA核巧酸序列的高水平分泌现象此前从未有过报道。
[0046]为进一步分析该过程，将人服PA5、CALR和PDIA3基因克隆到与P抑C相似但 在其他酵母基因AD肥、TD肥、TPI1、TEF和EN02的不同启动子控制下的酵母表达载体 中。为了表达人BiP、巧网蛋白和E化57蛋白，使用了不同酿酒酵母株巧188c、AH-214u、 AH-214uApep4)。利用不同启动子和株获得的结果与图1所示结果非常相似。该表明天然 氨基酸序列人分子伴侣在酵母培养基中的分泌与使用特定启动子或株进行其合成无关，而 是酵母细胞的W下不同性质的综合