；（i)识别人蛋白的信号序列并将它们转位至ER内的能 力，但（ii)不能将人分子伴侣保留在其预定的细胞区室。该些性质并未被发现和/或利用 于在酵母中产生天然重组人蛋白。
[0047] 应注意，人分子伴侣的内源信号肤实际上不是分泌信号氨基酸序列，该是因为它 们仅用于将天然人蛋白导引至ER。当信号序列被切割时，人细胞中的分子伴侣蛋白保留在 ER中。即使在一些情况下显示出天然人分子伴侣被导引至细胞表面，但它们并不会被分泌 到细胞外侧。实际上，已知人邸分子伴侣蛋白是细胞内蛋白。因此，本发明人在此首次显 示出了酵母将细胞内人蛋白利用其天然信号序列进行分泌的能力，W进行细胞内加工和细 胞内成熟蛋白的转运。已知一些分泌的人蛋白可利用其天然分泌信号序列而在酵母细胞中 分泌化itzeman等，1983 ;Barr等，1992)。该方法利用人干扰素为例在1988年获得专利权 化itzeman和Leung, 1988);该方法还在1994年使用，并获得了对人血清白蛋白利用其天然 分泌信号序列在毕赤酵母中表达的专利（Prevatt和Sreekrishna，1994)。然而，在大多数 情况中酿酒酵母a-MF前信号序列原被用于在其他异源蛋白在酵母中的分泌，因为天然分 泌信号序列效果较差（Cere曲ino和化egg, 2000)。本发明人的发现不同于此前的观察，天 然信号序列可驱动分泌性人蛋白在酵母中的分泌。可W预见的是，分泌性人蛋白利用相同 的信号序列也可W在酵母细胞中分泌。相反，细胞内人蛋白例如ER驻留的分子伴侣蛋白的 分泌对于在酵母中重组表达的类似物是不能预见的。此外，人m?分子伴侣蛋白在酵母中的 分泌水平出乎预料地高，并且可有效产生正确加工的重组产物。总之，本发明人大体上提出 了异源人蛋白在酵母细胞中分泌的新规程。
[0048] 所有=种分泌的人分子伴侣随后进行纯化和分析。分泌的重组人分子伴侣从培 养基中的纯化利用标准程序例如微孔过滤、超滤和一步层析和标准规程进行。该简单的 纯化程序足W实现纯度超过90%的天然重组人分子伴侣。该种简单有效的下游纯化程序 是所公开的表达系统的另一优点。进行通过Edman降解的N端测序W鉴定和表征纯化的 分泌蛋白。在所有=种情况下对来自酿酒酵母的分子伴侣蛋白产物的E血an测序（利用 AltaBioscience的服务进行）鉴定出5个N端氨基酸，并显示出它们对应于来自人细胞 的成熟天然分子伴侣蛋白产物（见表1:对于GRP78/BiP是NH2-EEEDK;对于巧网蛋白是 NH2-EPAVY和对于E化57是NH2-SDVLE)。该些结果表明人分子伴侣蛋白的天然邸信号序列 在酵母细胞中被识别和正确加工，并且该可W使重组蛋白转位到邸中，随后出乎预料地分 泌到酵母细胞外。为了检查所分泌蛋白产物的可能的修饰，本发明人进行全蛋白分子的电 喷雾质谱巧SI-M巧分析，W确定酵母分泌的人ER分子伴侣蛋白的确切分子量。表1和图 2中给出了质谱结果；表1指出了产物的精确测定分子量和预测分子量。
[0049] 表1.自酿酒酵母纯化的分泌的重组人分子伴侣的N端序列、预测分子量和测定分 子量
[00 加]
【主权项】
1. 一种产生重组蛋白的方法，所述方法包括 (a) 以核苷酸序列转化酵母细胞，所述核苷酸序列包含针对天然人内质网分子伴侣蛋 白信号序列和人内质网分子伴侣蛋白的编码序列； (b) 在人内质网重组分子伴侣蛋白以分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞；和 (c) 从培养基中提取所述人内质网重组分子伴侣蛋白。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述重组蛋白是人内质网重组分子伴侣蛋白。
3. 如权利要求1所述的方法，其中，所述酵母是酿酒酵母。
4. 如权利要求1所述的方法，其中，所述酵母是毕赤酵母。
5. 如权利要求2所述的方法，其中，所述人内质网重组分子伴侣蛋白选自由BiP/ GRP78、钙网蛋白和ERp57组成的组。
6. -种产生人内质网重组分子伴侣蛋白的方法，其中所述人内质网分子伴侣蛋白是人 内质网管腔蛋白，所述方法包括 (a) 在以分泌形式表达所述人内质网重组分子伴侣蛋白的条件下，培养酵母细胞，所述 酵母细胞转化有核苷酸序列，所述核苷酸序列包含针对天然人内质网分子伴侣蛋白信号序 列和人内质网分子伴侣蛋白两者的编码序列；和 (b) 从培养基中提取所述人内质网重组分子伴侣蛋白。
7. -种产生选自由MP/GRP78、钙网蛋白和ERp57组成的组的人内质网重组分子伴侣 蛋白的方法，所述方法包括 (a) 提供转化有核苷酸序列的酵母细胞，所述核苷酸序列包含针对天然人内质网分子 伴侣蛋白信号序列和人内质网分子伴侣蛋白的编码序列； (b) 在人内质网重组分子伴侣蛋白以分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细胞；和 (c) 从培养基中提取MP/GRP78、钙网蛋白或ERp57中的至少一种。
8. -种产生天然重组人MP/GRP78蛋白的方法，所述方法包括 (a) 提供至少一种转化有核苷酸序列的酿酒酵母细胞，所述核苷酸序列包含针对BiP/ GRP78分子伴侣蛋白信号序列和MP/GRP78分子伴侣蛋白两者的编码序列； (b) 在使MP/GRP78分子伴侣蛋白以分泌形式表达的条件下培养所述至少一种转化的 酿酒酵母细胞；和 (c) 从培养基中提取完全无损且具有活性的人MP/GRP78。
9. 如权利要求8所述的方法，其中，所述酵母是毕赤酵母。
10. -种产生天然重组人钙网蛋白的方法，所述方法包括 (a) 提供至少一种转化有核苷酸序列的酿酒酵母细胞，所述核苷酸序列包含针对钙网 蛋白分子伴侣蛋白信号序列和钙网蛋白分子伴侣蛋白两者的编码序列； (b) 在使钙网蛋白分子伴侣蛋白以分泌形式表达的条件下培养所述至少一种转化的酿 酒酵母细胞；和 (c) 从培养基中提取完全无损且具有活性的人钙网蛋白。
11. 如权利要求10所述的方法，其中，所述酵母是毕赤酵母。
12. -种产生天然重组人ERp57蛋白的方法，所述方法包括 (a)提供至少一种转化有核苷酸序列的酿酒酵母细胞，所述核苷酸序列包含针对ERp57分子伴侣蛋白信号序列和ERp57分子伴侣蛋白两者的编码序列； (b) 在致使ERp57分子伴侣蛋白以分泌形式表达的条件下培养所述至少一种转化的酿 酒酵母细胞；和 (c) 从培养基中提取完全无损且具有活性的人ERp57。
13. 如权利要求12所述的方法，其中，所述酵母是毕赤酵母。
14. 一种通过包括以下步骤的方法产生的人内质网重组分子伴侣蛋白： (a) 提供转化有核苷酸序列的酵母细胞，所述核苷酸序列包含针对天然人内质网分子 伴侣蛋白信号序列和人内质网分子伴侣蛋白两者的编码序列； (b) 在使所述人内质网重组分子伴侣蛋白以分泌的形式表达的条件下培养所述酵母细 胞；和 (c) 从培养基中提取所述人内质网重组分子伴侣蛋白。
15. 如权利要求14所述的蛋白，所述蛋白还包含组氨酸标签。
16. 如权利要求14所述的蛋白，所述蛋白还包含天然氨基酸序列。
17. 如权利要求14所述的蛋白，所述蛋白具有生物活性。
18. -种产生蛋白的方法，所述方法包括 (a) 以包含天然信号序列的全长人分子伴侣cDNA转化酵母细胞； (b) 在人内质网分子伴侣蛋白得到表达的条件下培养所述酵母细胞；和 (c) 从培养基中提取所述人内质网分子伴侣蛋白。
【专利摘要】一种利用酵母作为宿主产生人ER分子伴侣蛋白的方法，该方法利用了细胞内人蛋白的内源信号肽，该内源信号肽在酵母细胞中被识别和正确加工并随后致使人蛋白分泌。所得的蛋白具有天然氨基酸序列并具有生物学活性。此外，分泌使得可以以高产量简单地一步纯化天然重组人蛋白。
【IPC分类】C12P21-00
【公开号】CN104704126
【申请号】CN201380036854
【发明人】E·斯普利斯, R·斯利宾斯卡斯, K·萨斯诺斯卡斯, M·迈克拉克, L·I·戈尔德
【申请人】Uab巴尔特玛斯公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年7月10日
【公告号】CA2878672A1, EP2872644A1, US20150191713, WO2014011723A1