一种红豆杉多糖及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种红豆杉资源有效利用技术，具体设及一种红豆杉多糖及其制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 早在1856年Lucas就从欧洲红豆杉（Taxusbaccata)的叶中提取粉末碱性部分 taxine，但之后的进展很慢，直到20世纪60年代光谱技术飞速发展才有了比较深人的研 究。20世纪80年代美国和欧洲的科学家相继揭示出紫杉醇的抗癌疗效，全世界掀起了研 究红豆杉的高潮。虽然紫杉醇具有很好的抗癌效果，但是由于红豆杉中紫杉醇含量很低，且 多分布于树皮中，部分生产商为了提高紫杉醇产量而大量砍伐红豆杉，使红豆杉资源遭到 严重的破坏。此外，被提取紫杉醇后的红豆杉基本都被废弃，造成严重的资源浪费和环境污 染。
[0003] 为了解决红豆杉资源锐减、资源浪费与环境污染等问题，在红豆杉资源的利用与 开发上，不仅要研究和发展红豆杉种植的新技术，更重要的是要将提取紫杉醇类物质后的 红豆杉残余物进行再利用，深入研究其中新的活性组份的开发。目前在红豆杉小分子活性 物质的开发中，国内外都已取得不少进展，除紫杉醇具有抗肿瘤生物活性之外，红豆杉中还 含有二十多种紫杉烧类二祗化合物W及其他水溶生物活性物质。近年来，对红豆杉资源的 利用也已不再停留在对小分子活性物质的研究，越来越多的研究表明红豆杉中含有大量的 生物活性物质一-多糖，而且该些多糖具有抗肿瘤、调节免疫等活性。
[0004] 红豆杉多糖是从红豆杉中分离出来的具有生物活性的物质，具有增强免疫力、防 止屯、肌梗死及抗肿瘤等多种功能，具有广阔的应用前景。原菲等用MIT法研究了红豆杉多 糖TMP90W对体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7和肺癌细胞A549的生长抑制作用。TMP90W对 MCF-7和A549均有不同程度的抑制作用，且具有浓度依赖性。虽然其抑制作用较阳性对照 药物顺销较小，但TMP90W的毒性小，所W可作为抗肿瘤候选药物。Yin等先后从红豆杉中分 离出多糖TMP70W和TMP70S-1，并采用MIT法检测了两种红豆杉多糖对体外培养的肿瘤细胞 的抑制作用。结果表明TMP70W对K562细胞、MCF-7细胞均具有抑制作用；TMP70S-1对人宫 颈癌细胞化la和人纤维肉瘤细胞HT1080也具有抑制作用，且具有浓度依赖性。孔繁智等 研究发现红豆杉多糖具有缓解和稳定晚期肺、胃、乳腺、前列腺、大肠癌的疗效，可W保护人 体的T细胞使癌症患者的免疫功能保持在相对正常的状态。红豆杉多糖毒副作用小，药理 作用强，能减少化疗药物用量，降低化疗药物毒副作用，是癌症患者临床化疗的良好的辅助 药物，具备良好的药用前景。
[0005] 鉴于红豆杉多糖显著的生物活性，深入开发新的红豆杉多糖并用于疾病治疗就显 得十分必要。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种红豆杉多糖，该红豆杉多糖对人胃癌细胞具有显著的诱导调亡 作用。
[0007] 一种红豆杉多糖，其制备方法依次包括脱脂、提取、醇沉w及分离纯化，所述分离 纯化包括：
[000引 （1)W化C1溶液为洗脱剂，利用DEAEse地arose化Stflow树脂柱对醇沉获得的 粗多糖进行分离，获得浓度为0. 3M的化C1溶液洗脱的目标馈分；
[0009] 似W去离子水为洗脱剂，利用Se地dexG-10凝胶柱对目标馈分进行分离，在保 留时间为30min时获得所述红豆杉多糖。
[0010] 具体地，所述红豆杉多糖的制备方法包括：
[0011] 1、脱脂；取红豆杉枝叶碎屑，置于索氏提取器中用石油離回流提取，W抽提后的是 石油離挥发后不留下油迹为脱脂终点，脱脂后的红豆杉枝叶碎屑置于室温下通风惊干。
[001引 2、提取；
[0013] ①先用水对红豆杉枝叶碎屑进行微波提取，再置于95°C水浴中提取，分别获得水 提取液和残余物；
[0014] 作为优选，所述微波提取为；在900~1400W的功率下提取40~50s，提取次数为 至少S次，相邻的两次提取之间间隔4~5min;微波提取有利于促使红豆杉枝叶中的水溶 性物质更易释放出来，提高多糖提取率；间隔进行多次提取可避免因一次提取时间太长温 度太高而破坏里面的成分；
[0015] ②对所述残余物进行碱提，过滤取上清，调节上清抑至7. 0后将上清与所述水提 取液混合，浓缩获得浓缩液；
[0016] 作为优选，采用浓度为1. 0~1. 2mol/L的碱液进行碱提，所述残余物与碱液的固 液比为lg:18~20L，在70~80°C下碱提110~120min;
[0017] 更优选为；采用浓度为l.Omol/L的碱液进行碱提，残余物与碱液的固液比为 lg:20L，在 75°C下碱提 120min。
[0018] 3、醇沉；用体积分数为75~80%的己醇在温度低于4°C下对所述浓缩液过夜醇 沉，离屯、并清洗沉淀物，得到粗多糖。
[0019] 4、分离纯化；
[0020] (1)W化C1溶液为洗脱剂，利用DEAEse地arose化Stflow树脂柱对醇沉获得的 粗多糖进行分离，获得浓度为0. 3M的化C1溶液洗脱的目标馈分；
[002U 化Cl溶液的洗脱梯度依次为；0. 1M、0. 3M、0. 5M、0. 7M，洗脱速度为11. 5血/min,洗 脱体积均为1L;
[002引（2)W去离子水为洗脱剂，利用Se地dexG-10凝胶柱对目标馈分进行分离（去离 子水流速为0. 6mL/min)，在保留时间为30min时获得所述红豆杉多糖。
[0023] 对获得的红豆杉多糖进行凝胶渗透色谱（Gel化rmeationQiromatograpiGPC)和 紫外光谱扣ItravioletSpectrophotometry,UV)分析，可知其重均分子量为73527Da，并 且吸收峰为单一对称峰。
[0024] 对获得的红豆杉多糖进行气相色谱分析，可知该红豆杉多糖由葡萄糖、木糖、甘露 糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖W摩尔比1 ;〇. 38:0. 31 ;3. 11 ;1. 34:1. 92组成。
[0025] 对获得的红豆杉多糖进行红外光谱分析，发现其红外吸收图谱中具有W下吸收 峰；3413畑1-1，2923畑1-1，2846畑1-1，1735畑1-1，1614cm-i，1415畑1-1，1328畑1-1，1242畑1-1，1139cm-i， 1090cm-i，1072cm-i，1024cm-i，957cm-i，893cm-i，838cm-i，771cm-i，表明该红豆杉多糖中的糖巧 键主要为a-型。
[0026] 对获得的红豆杉多糖进行核磁共振分析，发现组成该红豆杉多糖的单糖异头物均 为a构型；多糖结构中还含有少量己酷基。
[0027] 对获得的红豆杉多糖进行高舰酸氧化和Smith降解分析，发现该红豆杉多糖中含 有1 一、1 一 3、1 一 2、1 一 6或者1 一 2, 6糖巧键；对获得的红豆杉多糖进行甲基化分析， 发现该红豆杉多糖的主链W(1 - 3)-阿拉伯糖和（1 一 4)-半乳糖为基本骨架，分支主要 含有（1 一 3, 6)-阿拉伯糖和（1 一 3, 6)-甘露糖，非还原性末端主要含有阿拉伯糖、葡萄糖 和半乳糖。
[002引本发明还提供了所述红豆杉多糖在制备抗胃癌药物中的应用。作为优选，所述抗 胃癌药物用于抑制SGC-7901细胞的生长增殖。并且，该红豆杉多糖与5-即联用时其对 SGC-7901细胞的诱导调亡效果能得到显著提高，即两者具有协同作用。
[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0030] (1)本发明在提取过程中对红豆杉枝叶先进行微波提取在进行95°C热水提取，微 波提取有利于促使红豆杉枝叶中的水溶性物质更易释放出来，提高多糖提取率；
[0031] (2)本发明在分离纯化过程中利用依次利用呢AEse曲arose化Stflow树脂柱和 Se地dexG-10凝胶柱对粗多糖进行分离，最终获得重均分子量为73527Da的红豆杉多糖， 该红豆杉多糖对人胃癌细胞SGC-7901具有显著的诱导调亡作用。
【附图说明】
[0032] 图1为红豆杉多糖CPTC-2在Se地dexG-10凝胶柱中的洗脱曲线；
[0033] 图2为红豆杉多糖CPTC-2的紫外全波段扫描图谱；
[0034] 图3为红豆杉多糖CPTC-2的GPC分析图谱；
[00对其中，Minutes表示（停留时间）分钟，MV表示电压毫伏，Mw表示重均分子量；
[0036] 图4为标准混合单糖和红豆杉多糖CPTC-2水解单糖的GC分析图谱；
[0037] 其中，min表示（保留时间）分钟，Thepeakhei曲t(nC)表示峰高（nC表示每个 峰组分的响应值）；A曲线表示标准混合单糖，B曲线表示红豆杉多糖CPTC-2水解单糖； [003引 图5为红豆杉多糖CPTC-2的红外光谱图；
[0039] 其中，Wavenumbercm-i表不波数（cm-1)，Transmittance!!% ]表不透光率（％ );
[0040] 图6为红豆杉多糖CPTC-2的咱谱图；
[0041] 图7为红豆杉多糖CPTC-2的"C谱图；
[0042] 图8A为实施例2中正常SGC-7901细胞的流式细胞分析结果图；
[0043] 其中，Count%表示各细胞周期阶段细胞百分数，Population表示细胞类群，Cells 表示总细胞，Apo表示调亡细胞，G0/1表示细胞周期处于G0/1期的细胞，S表示细胞周期处 于S期的细胞，G2/M表示细胞周期处于G2/M期的细胞；％Parent表示细胞百分数，Mean 表示平均巧光强度，％CV表示巧光强度变异系数（％ )，PI-A表示巧光强度；下同；
[0044] 图8B为实施例2中经CPTC-2处理后SGC-7901细胞的流式细胞分析结果图；
[0045] 图9A为实施例3中正常SGC-7901细胞的流式细胞分析结果图；
[0046] 图9B为实施例3中经5-FU处理后SGC-7901细胞的流式细胞分析结果图；
[0047] 图9C为实施例3中经CPTC-2处理后SGC-7901细胞的流式细胞分析结果图；
[0048] 图9D为实施例3中经CPTC-2和5-FU联合处理后SGC-7901细胞的流式细胞分析 结果图。
【具体实施方式】
[0049] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0化0]实施例1红豆杉多糖的提取和鉴定
[0化1] 1、红豆杉多糖的提取
[0化2] 本实施例一