优化的Fc变体及其产生方法
【专利说明】优化的Fe变体及其产生方法 本申请是申请日为2004年3月26日、中国申请号为201210057793. 1、发明名称为"优 化的Fe变体及其产生方法"的发明申请的分案申请。 本申请是2003年9月26日提交的USSN10/672,280的继续申请，根据35U.S.C. § 199 (e)，要求于2003年9月26日提交的USSN10/672280 ;2003年3月3日提交的USSN 10/379392 ;2003 年 6 月 12 日提交的USSN60/477, 839 ;2003 年 5 月 2 日提交的USSN 60/467, 606 ;2002 年 9 月 27 日提交的USSN60/414, 433 ;和 2003 年 1 月 23 日提交的USSN 60/442, 301的权益，所有它们全文内容在此明确引用作为参考。 发明领域 本发明涉及新的优化的Fe变体，产生它们的改造（engineering)方法，以及它们的应 用，具体而言用于治疗目的。 发明背景 抗体是结合特异性抗原的免疫蛋白。在包括人和小鼠的大多数哺乳动物中，抗体由配 对的多肽重链和多肽轻链构成。每条链由分离的免疫球蛋白（Ig)结构域组成，因此上述蛋 白通称免疫球蛋白。每条链由两个不同的区组成，称为可变区及恒定区。在抗体间轻链和 重链可变区显示了明显的序列多样性，并负责结合靶抗原。恒定区显示了较少的序列多样 性，并负责结合许多天然蛋白以引发重要的生化反应。在人类中有五种不同类型的抗体，包 括IgA(其包括亚类IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG(其包括亚类IgGl、IgG2、IgG3 和IgG4) 以及IgM。尽管在V区可能存在微小的差异，但是在这些类型的抗体间区别特征是它们的恒 定区。图1显示了IgGl抗体，在此用于举例说明免疫球蛋白的大致结构特征，IgG抗体是 由两条重链和两条轻链组成的四聚体蛋白。IgG重链由四个相连的免疫球蛋白结构域组成， 从N-末端到C-末端依次为VH-CyI-Cy2-Cy3,分别称为重链可变区结构域、恒定区y1 结构域、恒定区y2结构域和恒定区y3结构域。IgG轻链由两个相连的免疫球蛋白结构域 组成，从N-末端到C-末端依次为Q，分别称为轻链可变区结构域和轻链恒定区结构域。 抗体的可变区含有该分子的抗原结合决定基，并因此决定了抗体对其靶抗原的特异 性。因为其与同一类型中其它抗体序列差别最明显，所以命名为可变区。大多数序列可变 性存在于互补决定区（⑶Rs)。总共有6个⑶Rs，每条重链和轻链各有3个，命名SVhCDRU VhCDR2、VhCDR3、'CDR1、'CDR2及'CDR3。在CDRs外的可变区称为骨架（FR)区。尽管 不像CDRs-样变化众多，但是在不同抗体间FR区存在序列可变性。总的来说，抗体的结构 特征提供了稳定的支架（FR区），在其上真正的抗原结合多样性（CDR)能得到研宄，通过免 疫系统以获得对广泛抗原的特异性。可获得多种来自不同生物体可变区片段的许多高分辨 率结构，一些可变区是非结合状态的，一些与抗原形成复合物。抗体可变区的序列和结构特 征得到充分鉴定（Morea等?，1997,BiophysChem68 :9-16 ;Morea等?，2000,Methods20 : 267-279)，抗体的保守特征已用于发展许多抗体改造技术（Maynard等.，2000,AnnuRev BiomedEng2 :339-376)。例如，可将来自一种抗体，如鼠抗体的⑶Rs移植入另一种抗体的 骨架区，如人抗体。在本领域称为"人源化"的该过程能从非人抗体中能产生具更低免疫原 性的抗体治疗剂。存在着包含可变区的片段，其缺少抗体其它区域，包括诸如包含vh-cyI和Vh-Q的抗原结合片段（Fab)、包含的可变区片段（Fv)、包含在同一链中连接在 一起的％和八的单链可变区片段（scFv)以及多种其它可变区片段（Little等.，2000， Tmmun〇IToday21:364-370)。 抗体的Fc区与许多Fc受体及配体相互作用，行使一系列重要的功能，称为效应器功能(effectorfunction)。如图1所示，IgGFc区包含Ig结构域Cy2、Cy3和进入Cy2的 N-末端铰链。对于IgG类而言，一类重要的Fc受体家族是FeY受体（FcyR)。这些受体介 导抗体与免疫系统的细胞臂之间的信息传递（communication) (Raghavan等?，1996,Annu RevCellDevBiol12 :181-220;Ravetch等?，2001，AnnuRevImmunol19 :275-290) 〇 在人类中，该蛋白质家族包含FeYRI(CD64)，包括同种型（isoform)FeYRIa、FeYRIb和 FeyRIc;FcyRII(CD32)，包括同种型FeyRIIa(包含同种异型（allotype)H131 和R131)、 FeyRIIb(包含FeyRIIb-I和FeyRIIb-2)以及FeyRIIc;和FeyRIII(CD16)，包括同种 型FcyRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcyRIIIb(包括同种异型FcyRIIIb-NAl 和FcyRIIIb-NA2)(Jefferis等，2002,ImmunolLett82:57-65)。这些受体通常具有介 导与Fe结合的胞外结构域、跨膜区和可介导某些细胞内信号事件的胞内结构域。这些受 体在不同的免疫细胞中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性细 胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗罕氏细胞，自然杀伤（NK)细胞以及YYT 细胞。Fc/FcYR复合物的形成招募这些效应细胞至结合抗原的位点，通常导致细胞内信号 事件以及随后重要的免疫应答发生，诸如释放炎症介质、B细胞活化、细胞内吞作用、吞噬 作用及细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬细胞效应器功能的能力是抗体破坏靶细胞的 一种可能机制。在细胞介导反应中表达FeYR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的 结合的抗体并随后导致靶细胞溶胞作用，称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC) (antibodydependentcell-mediatedcytotoxicity)(Raghavan等?，1996，AnnuRevCell DevBiol12 :181-220;Ghetie等?，2000，AnnuRevImmunol18 :739-766;Ravetch等?， 2001，AnnuRevImmunol19:275-290)。在细胞介导反应中表达FcyR的非特异性细胞毒 性细胞识别靶细胞上的结合的抗体并随后导致对靶细胞的吞噬作用，称为抗体依赖性细胞 介导的细胞吞作用（ADCP)(antibodydependentcell-mediatedphagocytosis)。已解 出人FeyR的胞外结构域的许多结构，包括FeyRIIa(pdb登记号1H9V) (Sondermann等.， 2001，JMolBiol309 :737-749)(pdb登记号 1FCG)(Maxwell等?，1999,NatStructBiol 6 :437-442)，FcyRIIb(pdb登记号 2FCB)(Sondermann等.，1999,EmboJ18:1095-1103); 以及FeyRIIIb(pdb登记号 1E4J)(Sondermann等?，2000,Nature406 :267-273.)。所有 FeyR结合Fc上相同区域，位于Cy2结构域的N-末端和前述铰链区，如图2所示。该相互 作用可很容易地通过结构来鉴定（Sondermann等.，2001，JMolBiol309 :737-749)，并已 解出与人FeyRIIIb胞外结构域结合的人Fc的数种结构（pdb登记号1E4K)(Sondermann 等.，2000,Nature406 :267-273.)(pdb登记号IIIS和 1IIX)(Radaev等.，2001，JBiol Chem276 :16469-16477)，也解出人IgEFc/FcgRIa复合物结构（pdb登记号 1F6A)(Garman 等?，2000,Nature406 :259-266) 〇 不同IgG亚类对FeYR具有不同亲和力，IgGl和IgG3 -般较IgG2和IgG4能更充