抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种卵黄抗体的制备方法，具体是一种治疗猪传染性胃肠炎病毒与猪 流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胃肠炎（porcinetransmissiblegastroenteritis,TGE)和猪流行性 腹泻（porcineepidemicdiarrhoea,PED)是引起猪腹泻的两种重要接触性病毒性肠道传 染病，均以呕吐、严重水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪的高度致死率为特征。目前尚无 有效的治疗方法。临床上经常有猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻感染发生的报道，严重制 约养殖业的顺利发展。
[0003] 卵黄抗体与初乳中母源抗体的作用机理相似，都是以被动免疫的方式使仔猪获得 免疫力，达到保护仔猪的目的。因而研制抗猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻卵黄抗体，用于 猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻的防制具有重要意义。
[0004] 曾有抗猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒卵黄抗体制备的报道，但是随着 临床流行毒株的变异，原有卵黄抗体保护性越来越差。本试验以临床上新近分离的猪传染 性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒流行毒株为免疫抗原，免疫产蛋鸡，收集高效价卵黄，并 对制备的卵黄抗体的治疗效果进行了研究，从而为防制猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻， 提供一种成本低、治疗效果好、易于生产且无环境污染的生物制品。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供一种猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵 黄抗体的制备制备方法。
[0006] 本发明提供的抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其为以猪传 染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的二联灭活疫苗为免疫原，免疫产蛋鸡，再从卵黄中 纯化出卵黄抗体而成，其中，所述的猪传染性胃肠炎病毒为猪传染性胃肠炎病毒HB08株， 其保藏号为CGMCCNo. 7807,所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏 号CGMCCNo. 7806。
[0007] 其中，所述的二联灭活疫苗为弗氏完全佐剂疫苗或弗氏不完全佐剂疫苗。
[0008] 本发明提供的猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备方法，包 括如下步骤： 1)制备猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV二联灭活疫苗：将猪传染 性胃肠炎病毒HB08株和猪流行性腹泻病毒ZJ08株病毒液等病毒量混合，加入0. 2~0. 5%的 甲醛，置于35°C~37°C恒温培养箱24h~36h进行灭活，加入等量的弗氏完全佐剂或弗氏不完 全佐剂制备成猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联弗氏完全佐剂疫苗或弗氏不完全佐剂 疫苗； 2) 动物免疫：免疫方式均为胸部肌肉分点注射，共免疫五次。首免、二免、三免均间隔 两周，三免后一个月四免，四免后两周五免。首次免疫ImlTGEV-PEDV二联弗氏完全佐剂疫 苗，二免、三免和四免均接种TGEV-PEDV二联弗氏不完全佐剂疫苗，剂量分别为分别为2ml 、4ml和2ml，五免接种2mlTGEV-PEDV二联病毒液， 3) 抗体效价测定：第五次免疫后1周开始每隔7日收集高免蛋，并利用琼脂扩散试验 检测高免卵黄抗体效价，待卵黄抗体效价达到1:64时收集卵黄； 4) 卵黄抗体的纯化：无菌条件下收集卵黄，先后加入2倍体积的PBS缓冲液（0. 01M， pH7. 2)和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和35%硫酸铵沉淀卵黄 抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的PBS缓冲液中，4°C透析24小时，即为提纯卵黄抗体。
[0009] 在本发明一个实施方案中，将猪流行性腹泻病毒ZJ08株与细胞维持液按 1:5(Tl: 100的比例接种到已长满单层的ST细胞上，将猪传染性胃肠炎病毒HB08株与细 胞维持液按l:5(Tl:100的比例接种到已长满单层的VeroE6细胞上，两种病毒均置于 35°C~38°C培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，病毒量为彡107_°TCID5Q/ml。
[0010] 本发明的PEDVZJ08株是申请人从浙江一发病猪场分离到的强毒株经过105代致 弱后获得的猪流行性腹泻病毒弱毒株，是目前国内的PEDV流行株，该疫苗株毒力稳定，安 全，免疫原性好，能够抵抗目前临床上流行的强毒株的攻击，保护率达90%以上。
[0011] 将分离到的PEDV105-145代PEDV致弱株命名为猪流行性腹泻病毒ZJ08株，保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCCNo. 7806,保藏时间是2013年6 月28日。
[0012] 本发明的TGEVHB08株是申请人从河北一发病猪场分离到的强毒株经过125代致 弱后获得的TGEV弱毒株，是目前国内的TGEV流行株，该疫苗株毒力稳定，安全，免疫原性 好，能够抵抗目前临床上流行的强毒株的攻击，保护率达90%以上。
[0013] 将分离到的TGEV125-165代TGEV致弱株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，保藏编号是CGMCCNo. 7807,保藏时间是2013年6月28日。
[0014] 本发明还提供所述的卵黄抗体在制备治疗猪传染性胃肠炎病毒和/或猪流行性 腹泻病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
[0015] 本发明成功试制出了猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体，其物理 性状良好，无细菌生长，纯化的抗体效价达1:128。人工感染治疗试验结果表明，本发明制备 的卵黄抗体治愈率达100%，明显高于经典毒株制备的卵黄抗体治愈率；临床治疗试验治愈 率为93. 0%，比经典毒株制备的卵黄抗体治愈率高6个百分点；临床预防试验中，与对照组 相比，本发明可使试验猪的腹泻发生率降低17~24个百分点，而经典毒株制备的卵黄抗体 仅可使试验猪的腹泻发生率降低9~12个百分点。
【附图说明】
[0016]图 1 为PEDVCPE图片（400X)。
[0017] 图2为PEDV分离毒S基因PCR检测结果。图中，1:样品；2:阴性对照；M:DNA MarkerDL2000〇
[0018] 图3为PEDV分离毒M基因PCR检测结果。图中，1:样品；2:阴性对照；M:DNA MarkerDL2000〇
[0019] 图4为PEDV分离毒M基因系统进化分析结果。
[0020] 图5为PEDV分离毒0RF3基因PCR检测结果。图中，1:样品；2:阴性对照；M: DNAMarkerDL2000。
[0021] 图6为不同代次PEDV0RF3序列比对结果。
[0022] 图 7 为TGEVCPE图片（400X)。
[0023] 图8为TGEV分离毒S基因PCR检测结果。图中，M:DNAMarkerDL2000 ;1:样品； 2:阴性对照。
[0024] 图9为不同代次TGEV0RF3序列比对结果。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026] 实施例1猪流行性腹泻病毒ZJ08株病毒液的制备 取浙江某猪场猪流行性腹泻阳性小肠适量，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例（重 量：体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0. 22iim滤膜过滤，滤液中加入终浓度为 20iig/ml的胰酶，37°C处理1. 5小时。
[0027] 按常规方法接种长满单层的Vero细胞，按照10%的比例接种病毒，37°C吸附1小 时，补足细胞维持液(含lOKg/ml的胰酶)，37°C温箱培养。传至第17代时则出现明显、稳定 的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈葡萄串样，细胞出现损伤和脱落（图1)。
[0028] 根据S基因设计检测引物对：正向引物为5 ' -GGATACTTTGGCCTCTTGTG-3 '；反向 引物为 5'-CGCACTCGGATTACTCACAGC-3'，95°C预变性 5min，95°C45s、50°Clmin、72°C 2min进行32个循环后，72°C5min延伸。PEDV扩增片段为484bp。结果见图2。
[0029] 根据GenBank中PEDV的基因序列设计扩增M基因序列的引物： PEDV-M-F:GTCTTACATGCGAATTGACC PEDV-M-R:GGCATAGAGAGATAATGGCA 扩增的M基因片段的大小为：808bp，结果见图3,序列如SEQIDNo. 5所示。
[0030] 结果表明，PEDV(ZJ08株）与经典参考株如英国CV777株、比利时Brl/87株、韩 国KPD-9F株和日本JMe2株等相比，不在一个进化分支上，已经发生了明显的变异（图4)，为 国内新发现的流行株。
[0031] 扩增0RF3序列的引物为： 0RF3-F:TCCTAGACTTCAACCTTACG0RF3-R:GGTGACAAGTGAAGCACAGA 扩增的0RF3的片段的大小为：833bp(图5)。
[0032] 将猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代100代，并在此过程进行了克隆纯 化，然后继续在Vero细胞上传代至145代。将第145代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因 片段为484bp。PEDVZJ08株0RF3基因序列在第105代开始0RF3基因突然出现49个核苷 酸的缺失，第105代、125代、145代保持稳定缺失49个核苷酸（图6)，序列如SEQIDNo. 6 所示。
[0033] 按现行《中国兽药典》附录对第105~145代病毒进行无菌、支原体及外源病毒检 验，结果无细菌，霉菌，支原体及外源病毒污染。
[0034] 将分离致弱的105145代致弱株种毒命名为PEDVZJ08株，其微生物保藏号是 CGMCCNo. 7806 ;保藏时间是2013年6月28日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所。
[0035] 取PEDVZJ08株第125代与细胞维持液按1:50的比例接种到已长满单层的 Vero细胞上，置于37°C培养，待80%细胞出现病变时收获病毒，测定毒价，病毒含量为 107_ 5TCID5Q/ml，-20°C保存备用 实施例2猪传染性胃肠炎病毒HB08株病毒液的制备 取河北某猪场猪传染性胃肠炎阳性小肠适量，刮取肠粘膜和内容