鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原的成套产品的制作方法_2

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由所述rv和名称为PRV的鉴定或辅助鉴定狂犬病病毒的探针组成; [0040] 所述CTox由所述tox和名称为PTox的鉴定或辅助鉴定弓形虫的探针组成; [0041] 所述CLep由所述Iep和名称为PLep的鉴定或辅助鉴定钩端螺旋体的探针组成;
[0042] 所述CXDV由所述cdv和名称为P⑶V的鉴定或辅助鉴定犬瘟热病毒的探针组成;
[0043] 所述CICHV由所述ichv和名称为PICHV的鉴定或辅助鉴定犬传染性肝炎病毒的 探针组成;
[0044] 所述CCPV由所述cpv和名称为PCPV的鉴定或辅助鉴定犬细小病毒的探针组成;
[0045] 所述PRV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 3的DNA ;
[0046] 所述PTox为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 6的DNA ;
[0047] 所述PLep为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 9的DNA ;
[0048] 所述TCDV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 12的DNA ;
[0049] 所述PICHV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 15的DNA ;
[0050] 所述PCPV为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No. 18的DNA ;
[0051] 所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和 犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
[0052] 其中,探针PRV的结合位点在所述rv从狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)的总RNA 中进行PCR扩增得到272bp的DNA片段上,SEQ ID No. 3由20个核苷酸组成;探针PTox的 结合位点在所述tox从刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,Tox)的基因组DNA中进行PCR扩 增得到189bp的DNA片段上,SEQ ID No. 6由22个核苷酸组成;探针PL印的结合位点在所 述Iep从钩端螺旋体(Pathogenic Leptospira)的基因组DNA中进行PCR扩增得到146bp 的DNA片段上,SEQ ID No. 9由22个核苷酸组成;探针K:DV的结合位点在所述cdv从犬瘟 热病毒(Canine distemper virus, CDV)的总 RNA 中进行 RT-PCR 扩增得到 218bp 的 DNA 片 段上,SEQ ID No. 12由18个核苷酸组成;探针PICHV的结合位点在所述ichv从犬传染性 肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus,ICHV)的基因组 DNA 中进行 PCR 扩增得 到258bp的DNA片段上,SEQ ID No. 15由20个核苷酸组成;探针PCPV的结合位点在所述 cpv从犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的基因组DNA中进行PCR扩增得到175bp的 DNA片段上,SEQ ID No. 18由18个核苷酸组成。
[0053] 上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中,所述成套试剂由所述CRV、所述CTox、所 述CLep、所述CXDV、所述CICHV和所述CCPV这六种引物探针组合物中的五种、四种、三种、 两种或一种组成;
[0054] 所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和 犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
[0055] 上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中,所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所 述ichv和所述cpv均可独立包装。
[0056] 上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中,所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所 述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可独立包装。
[0057] 上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中,所述PRV、所述PTox、所述PLep、所述 P⑶V、所述PICHV和所述PCPV均可独立包装。
[0058] 上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中,所述rv、所述tox、所述lep、所述cdv、所 述ichv和所述cpv的两条单链DNA均可用生物素标记。
[0059] 上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中,所述PRV、所述PTox、所述PLep、所述 P⑶V、所述PICHV和所述PCPV均可进行氨基化修饰。
[0060] 上述鉴定或辅助鉴定病原的成套试剂中,所述PRV、所述PTox、所述PLep、所述 P⑶V、所述PICHV和所述PCPV均可在其5'端进行氨基化修饰。
[0061] 上述PCR引物对组合物或上述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定病原的试剂或试 剂盒中的应用,也属于本发明的保护范围。
[0062] 上述PCR引物对组合物或上述成套试剂在制备鉴定或辅助鉴定病原的试剂或试 剂盒中的应用中,所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎 病毒和犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
[0063] 下述Ml)-M3),也属于本发明的保护范围:
[0064] Ml)上述PCR引物对组合物的制备方法,包括将上述PCR引物对组合物中各引物对 或/和各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤;
[0065] M2)上述成套试剂的制备方法,包括将上述成套试剂中各探针或/和各引物对或/ 和各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤;
[0066] M3)上述试剂或试剂盒的制备方法,包括将上述引物探针组合物中各探针或/和 各引物对或/和各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
[0067] 含有上述PCR引物对的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品(液相芯片检测系统),也 属于本发明的保护范围。
[0068] 含有上述成套试剂的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品(液相芯片检测系统),也 属于本发明的保护范围。
[0069] 上述含有上述成套试剂的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品中,所述成套产品中含 有所述探针分别与荧光编码微球进行偶联得到的荧光微球混合物。
[0070] 为解决上述技术问题,本发明还提供了 PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品 或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定病原中的应用。
[0071] 本发明所提供的PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴 定或辅助鉴定病原中的应用中,所述PCR引物对组合物为上述PCR引物对组合物,所述成套 试剂为上述成套试剂,所述成套产品为含有上述PCR引物对的鉴定或辅助鉴定病原的成套 产品或含有上述成套试剂的鉴定或辅助鉴定病原的成套产品,所述试剂或试剂盒为上述试 剂或试剂盒;
[0072] 所述病原为狂犬病病毒、弓形虫、钩端螺旋体、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒和 犬细小病毒这六种病原中的六种、五种、四种、三种、两种或一种。
[0073] 上述PCR引物对组合物或成套试剂或成套产品或试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴 定病原中的应用中,所述应用包括下述(1)和(2),和/或,(3),和/或,(4)的步骤:
[0074] (1)在同一个PCR反应体系中,以待测病原的总RNA为模板,用所述rv和所述cdv 进行RT-PCR扩增得到PCR产物1 ;
[0075] 如果所述PCR产物1含有272bp的DNA片段,所述待测病原中含有狂犬病病毒或 候选含有狂犬病病毒;如果PCR产物1不含有272bp的DNA片段,所述待测病原中不含有狂 犬病病毒或候选不含有狂犬病病毒;如果所述PCR产物1含有218bp的DNA片段,所述待测 病原中含有犬瘟热病毒或候选含有犬瘟热病毒;如果PCR产物1不含有218bp的DNA片段, 所述待测病原中不含有犬瘟热病毒或候选不含有犬瘟热病毒;
[0076] (2)在同一个PCR反应体系中,以待测病原的基因组DNA为模板,用所述tox、所述 lep、所述ichv和所述cpv进行PCR扩增得到PCR产物2 ;如果所述PCR产物2含有189bp 的DNA片段,所述待测病原中含有弓形虫或候选含有弓形虫;如果PCR产物2不含有189bp 的DNA片段,所述待测病原中不含有弓形虫或候选不含有弓形虫;如果所述PCR产物2含有 146bp的DNA片段,所述待测病原中含有钩端螺旋体或候选含有钩端螺旋体;如果PCR产物 2不含有146bp的DNA片段,所述待测病原中不含有钩端螺旋体或候选不含有钩端螺旋体; 如果所述PCR产物2含有258bp的DNA片段,所述待测病原中含有犬传染性肝炎病毒或候 选含有犬传染性肝炎病毒;如果PCR产物2不含有258bp的DNA片段,所述待测病原中不含 有犬传染性肝炎病毒或候选不含有犬传染性肝炎病毒;如果所述PCR产物2含有175bp的 DNA片段,所述待测病原中含有犬细小病毒或候选含有犬细小病毒;如果PCR产物2不含有 175bp的DNA片段,所述待测病原中不含有犬细小病毒或候选不含有犬细小病毒;
[0077] (3)用所述PRV与所述PCR产物1进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原 中含有狂犬病病毒或候选含有狂犬病病毒;如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有 狂犬病病毒或候选不含有狂犬病病毒;
[0078] 用所述PCDV与所述PCR产物1进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中 含有犬瘟热病毒或候选含有犬瘟热病毒;如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有犬 瘟热病毒或候选不含有犬瘟热病毒;
[0079] 用所述PTox与所述PCR产物2进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中 含有弓形虫或候选含有弓形虫,如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有弓形虫或候 选不含有弓形虫;
[0080] 用所述PLep与所述PCR产物2进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中 含有钩端螺旋体或候选含有钩端螺旋体,如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有钩 端螺旋体或候选不含有钩端螺旋体;
[0081] 用所述PICHV与所述PCR产物2进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中 含有犬传染性肝炎病毒或候选含有犬传染性肝炎病毒,如果杂交结果为阴性,所述待测病 原中不含有犬传染性肝炎病毒或候选不含有犬传染性肝炎病毒;
[0082] 用所述PCPV与所述PCR产物2进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中 含有犬细小病毒或候选含有犬细小病毒,如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有犬 细小病毒或候选不含有犬细小病毒;
[0083] (4)用所述PRV与所述病原进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中含有 狂犬病病毒或候选含有狂犬病病毒;如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有狂犬病 病毒或候选不含有狂犬病病毒;
[0084] 用所述PCDV与所述病原进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中含有犬 瘟热病毒或候选含有犬瘟热病毒;如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有犬瘟热病 毒或候选不含有犬瘟热病毒;
[0085] 用所述PTox与所述病原进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中含有弓 形虫或候选含有弓形虫,如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有弓形虫或候选不含 有弓形虫;
[0086] 用所述PLep与所述病原进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中含有钩 端螺旋体或候选含有钩端螺旋体,如果杂交结果为阴性,所述待测病原中不含有钩端螺旋 体或候选不含有钩端螺旋体;
[0087] 用所述PICHV与所述病原进行杂交,如果杂交结果为阳性,所述待测病原中含有 犬传染性肝炎病毒或候选含有犬传染性肝炎病毒,如果杂交结果为阴性,所述待测病原中 不含有犬传染性肝炎病毒或候选不含有犬传染性肝炎病毒;
[0088] 用所述PCPV与所述病原进
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