组DNA。
[0063] 具体结果如图2所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值 小于38,则判断为阳性，如果38〈Ct〈40,判断为可疑，可疑加大模板量，重复扩增，如果得到 相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40,则判断为阴性。
[0064] 从图2可以看出，DNA抽提液、10、100、1000倍稀释的DNA抽提液都能扩增出反应 曲线，其Ct都小于38,判断为阳性，1000倍稀释的溶液中的DNA浓度为lOOcopies/ml。由 此，本发明的焚光检测引物的检测下限为l〇〇copies/ml。
[0065] 实施例2 :重复性
[0066] 1、两只携带伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的蚊子经二氧化碳熏晕后，解剖腹部分 别置于0. 2ul EP管中；
[0067] 2、加入 20ul DNA 提取液（DNA 提取液的配方为：30mM Na0H、0. 25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶剂为水，使用前需振荡，将白色片状物一同加入）；
[0068] 3、充分混匀；
[0069] 4、瞬时离心后，99°C温浴10分钟；
[0070] 5、得到DNA抽提液，-20°C保存，即获得伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的基因组 DNA ；
[0071] 6、上述伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA作为模板DNA进行10次重复， 共计20个样本；
[0072] 7、PCR扩增体系：
[0073] 模板 DNA 2 μ I、PCR A 液 18 μ 1 和 PCR B 液 2 μ 1。
[0074] 所述的 PCR A 液，每 18 μ 1 含有 IOpmol 荧光检测引物 wAlbBF(5'-TTGATCTCTTTAGT AGCTGATACTG-3'）、IOpmol 荧光检测引物 wAlbBR(5'-CAGTTAAAGATCAAAAAGGATTT GG-3'）、5pmol 探针 A(5' -CACCATAAGAACCAAAATAACGAGCAC-3'，探针的两端分别结合 有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1)，IOpmol荧光检测引物wPipF(5' -GTCTTT CAATTGAAAAGATTC-3'）、IOpmol 荧光检测引物 wPipR(5, -AAGAATTGTCATTCCGTCTG C-3'）、 5pmol探针B(5' -TCTCCCCAAAATATAGCC-3'，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧 光淬灭基团BHQl)，其余为pH值为8. 0的缓冲液。所述的缓冲液成份为50mmol/L Tris-HCl、 8mmol/L MgC12、250mmol/L KC1，溶剂为水。
[0075] 所述的PCR B液由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，每2 μ I PCR B液中含有 热启动Taq酶5U、逆转录酶2. 5U和dNTPs lOmmol，其余为水。
[0076] 8、混匀后进行PCR扩增；
[0077] 9、PCR反应条件：
[0078] 预变性 5CTC 2min
[0079] 95 °C 15min
[0080] 扩增 94 °C 15s
[0081] 55°C 45s 40个循环，55°C时收集荧光
[0082] 10、扩增结束后观察扩增曲线。
[0083] 具体结果如图3所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增反应曲线，且Ct值 小于38,则判断为阳性，如果38〈Ct〈40,判断为可疑，可疑加大模板量，重复扩增，如果得到 相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40,则判断为阴性。
[0084] 从图3可以看出，2份伊蚊B型和库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA样品各10次重 复都能扩增出反应曲线，其Ct都小于38,判断为阳性，由此说明，本发明的荧光检测引物能 够同时检测出伊蚊B型和库蚊沃尔巴克氏体，并且重复性好。
[0085] 实施例3 :特异性
[0086] 1、两只含单A型的沃尔巴克氏体、两只含单B型的沃尔巴克氏体的白纹伊蚊和两 只广州致倦库蚊（含库蚊沃尔巴克氏体），共6只蚊子经二氧化碳熏晕后，解剖腹部分别置 于0. 2ul EP管中；
[0087] 2、分别加入20ul DNA提取液（DNA提取液的配方为：30mM Na0H、0. 25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶剂为水，使用前需振荡，将白色片状物一同加入）；
[0088] 3、充分混匀；
[0089] 4、瞬时离心后，99°C温浴10分钟；
[0090] 5、得到DNA抽提液，-20°c保存，即分别获得两份伊蚊A型沃尔巴克氏体的基因组 DNA、两份伊蚊B型沃尔巴克氏体的基因组DNA和两份库蚊沃尔巴克氏体的基因组DNA共六 份，以这六份基因组DNA分别作为模板DNA进行PCR扩增。
[0091] 6、
[0092] PCR 组 1 :
[0093] 模板 DNA 2 μ I、PCR A 液 18 μ 1 和 PCR B 液 2 μ 1。
[0094] 所述的 PCR A 液，每 18 μ 1 含有 IOpmol 荧光检测引物 wAlbBF (5' -TTGATCTCTTTAGT AGCTGATACTG-3'）、IOpmol 荧光检测引物 wAlbBR(5' -CAGTTAAAGATCAAAAAGGATTT GG-3'）、 5pmol探针A(5' -CACCATAAGAACCAAAATAACGAGCAC-3'，探针的两端分别结合有荧光发生基 团FAM和荧光淬灭基团BHQl)，其余为pH值为8. O的缓冲液。所述的缓冲液成份为50mmol/ L Tris-HCl、8mmol/L MgC12、250mmol/L KC1，溶剂为水。
[0095] 所述的PCR B液由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，每2 μ I PCR B液中含有 热启动Taq酶5U、逆转录酶2. 5U和dNTPs lOmmol，其余为水。
[0096] PCR 组 2 :
[0097] 模板 DNA 2 μ I、PCR A 液 18 μ 1 和 PCR B 液 2 μ 1。
[0098] 所述的 PCR A 液，每 18 μ 1 含有 IOpmol 荧光检测引物 wPipF(5'-GTCTTTCAATTGAA AAGATTC-3'）、IOpmol 荧光检测引物 wPipR(5' -AAGAATTGTCATTCCGTCTGC-3'）、5pmol 探针 B (5' -TCTCCCCAAAATATAGCC-3'，探针的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团 BHQl)，其余为pH值为8. 0的缓冲液。所述的缓冲液成份为50mmol/L Tris-HCl、8mmol/L MgC12、250mmol/L KC1，溶剂为水。
[0099] 所述的PCR B液由热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs组成，每2 μ I PCR B液中含有 热启动Taq酶5U、逆转录酶2. 5U和dNTPs lOmmol，其余为水。
[0100] 8、混匀后进行PCR扩增；
[0101] 9、PCR反应条件：
[0102] 预变性 5CTC 2min
[0103] 95 °C 15min
[0104] 扩增 94 °C 15s
[0105] 55°C 45s 40个循环，55°C时收集荧光
[0106] 10、扩增结束后观察扩增曲线。
[0107] 具体结果如图4、图5、图6和图7所示，结果判断标准：如果出现待测基因的扩增 反应曲线，且Ct值小于38,则判断为阳性，如果38〈Ct〈40,判断为可疑，可疑加大模板量，重 复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为阳性，否则为阴性，如果Ct值为0或40,则判断 为阴性。
[0108] 从图4和图5可以看出，FAM通道（只用针对伊蚊B型沃尔巴克氏体的荧光检测 引物WAlbBF、wAlbBR和探针A，PCR组1)只显示伊蚊B型沃尔巴克氏体的扩增曲线，其为阳 性，而A型沃尔巴克氏体和库蚊沃尔巴克氏体都没有扩增曲线，为阴性。
[0109] 从图6和图7可以看出，HEX通道（只用针对库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物 wPipF、wPipR和探针B，PCR组2)只显示库蚊沃尔巴克氏体的扩增曲线，其为阳性，而A型 沃尔巴克氏体和B型沃尔巴克氏体都没有扩增曲线，为阴性。
[0110] 由此说明，本发明的荧光检测引物只检测出伊蚊B型沃尔巴克氏体和库蚊沃尔巴 克氏体，而A型沃尔巴克氏体不发生扩增，并能分辨出伊蚊B型沃尔巴克氏体和库蚊沃尔巴 克氏体。
【主权项】
1. 一种伊蚊B型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物，其特征在于，包括 (1) 针对伊蚊B型沃尔巴克氏体： wAlbBF:5' -TTGATCTCTTTAGTAGCTGATACTG-3' ；wAlbBR:5' -CAGTTAAAGATCAAAAAGGATTTGG-3' ； 探针A:5' -CACCATAAGAACCAAAATAACGAGCAC-3' ； 探针A的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl; (2) 针对库蚊沃尔巴克氏体： wPipF:5' -GTCTTTCAATTGAAAAGATTC-3' ；wPipR:5' -AAGAATTGTCATTCCGTCTGC-3' ； 探针B:5' -TCTCCCCAAAATATAGCC-3' ； 探针B的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQl。2. -种非疾病的诊断和治疗目的的伊蚊B型和库蚊沃尔巴克氏体的检测方法，其特征 在于，提取样品DNA，以该样品DNA为模板，使用权利要求1所述的伊蚊B型和库蚊沃尔巴克 氏体的荧光检测引物wAlbBF、wAlbBR、探针A、wPipF、wPipR和探针B进行荧光定量PCR扩 增，扩增反应完成后，根据探针标记的荧光发生基团的荧光信号，读取并记录样品的PCR循 环次数Ct，根据样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品是否含有伊蚊B型和库蚊沃尔 巴克氏体。3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的进行荧光定量PCR扩增，其反 应条件为：预变性50°C5分钟，95°C15分钟；扩增94°C15秒、55°C45秒，40个循环；55°C 的时候收集焚光信号。4. 一种伊蚊B型和库蚊沃尔巴克氏体的检测试剂盒，包括荧光检测引物和PCR试剂，其 特征在于，所述的荧光检测引物包括： (1) 针对伊蚊B型沃尔巴克氏体： wAlbBF:5' -TTGATCTCTTTAGTAGCTGATACTG-3' ；wAlbBR:5' -CAGTTAAAGATCAAAAAGGATTTGG-3' ； 探针A:5' -CACCATAAGAACCAAAATAACGAGCAC-3' ； 探针A的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQl; (2) 针对库蚊沃尔巴克氏体： wPipF:5' -GTCTTTCAATTGAAAAGATTC-3' ；wPipR:5' -AAGAATTGTCATTCCGTCTGC-3' ； 探针B:5' -TCTCCCCAAAATATAGCC-3' ； 探针B的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQl。
【专利摘要】本发明公开了一种伊蚊B型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物及其检测方法和检测试剂盒。利用本发明的荧光检测引物按照本发明的检测方法能够快速高效专一的检测出伊蚊B型和库蚊沃尔巴克氏体，具有专一性强，特异性高(只检测出伊蚊B型和库蚊沃尔巴克氏体，而伊蚊A型沃尔巴克氏体不发生扩增)，灵敏度高，其最低检测限为100copies/ml。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104894274
【申请号】CN201510320878
【发明人】高秀洁, 杨翠, 周其伟, 李丽梅, 奚志勇, 朱俭, 罗永平
【申请人】奚志勇
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月11日