条形编码核酸的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求2012年11月5日提交的美国临时申请号61/722, 357的优先权权益， 该美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。
[0002] 序列表通过电子提交而随本文一起提交并且以引用的方式并入本文，所述序 列表被包含在被命名为" RUBCP0031W0_ST25.txt"的文件中，所述文件是2KB(如在 MicrosoftWindows?中所测量）并且在2013年11月5日创建。
技术领域
[0003] 本发明大体上涉及分子生物学和核酸测序的领域。更具体地说，它涉及条形编码 (barcoding)核酸的方法。
【背景技术】
[0004] 条形码可以被用于鉴定核酸分子，例如其中测序可以揭示与所关注的核酸分子连 接的特定条形码。在一些情况下，可以使用序列特异性事件来鉴定核酸分子，其中所述条形 码的至少一部分在所述序列特异性事件中被识别出，例如所述条形码的至少一部分可以参 与连接反应或延伸反应。所述条形码因此可以允许对与其连接的gDNA分子进行鉴定、选择 或扩增。
[0005] -种使条形码与所关注的核酸分子结合的方法包括制备Ion gDNA片段文库，如由 生命科技公司（Life Technologies)对于Ion Torrent系统所述。在这种方法中，使gDNA 的片段与衔接子连接，其中使每一个基因组DNA片段的至少一端与包含条形码的衔接子连 接。可以使用PCR用针对所述衔接子的引物对所连接的衔接子和gDNA片段进行切口修复、 尺寸选择、以及扩增以产生扩增的文库。举例来说，可以使用包括16种不同的条形码的连 接衔接子制备16种不同的gDNA样品，每一种gDNA样品具有独特的条形码，因此可以将每 一种样品通过PCR使用相同的PCR引物单独地扩增，然后汇集（混合在一起）或者可以首 先将每一种样品汇集，然后使用相同的PCR引物同时扩增。因此，每一种gDNA样品可以通 过它所附接的独特的条形码来被鉴定。然而，所需的不同的连接衔接子的数目等于条形码 的数目。举例来说，以混合物的形式产生能够被测序的256种样品文库将需要256种不同 的连接衔接子。
【发明内容】
[0006] 本发明的实施方案提供了制备用于测序的带双重条形码的核酸分子的方法。在核 酸分子的同一端上具有第一条形码和第二条形码可以容许测序读取从第二条形码开始，继 续经过第一条形码，然后进入到核酸分子中。因此可以在单次读取中获得对第二条形码、第 一条形码以及所述核酸分子的序列进行的鉴定，而不是不得不使得从核酸分子的每一端进 行测序读取以从核酸分子的远端向后对单个条形码的序列进行读取，正如在使用双重测序 条形码的传统方法中的情况那样。
[0007] 因而，本发明的一个实施方案涉及一种制备带双重条形码的核酸分子的方法，所 述方法包括：使茎-环寡核苷酸的一条链与核酸分子结合以形成第一条形码结合的核酸分 子，所述茎-环寡核苷酸包含分子内反向重复序列和环，所述反向重复序列包含第一条形 码；通过链置换或通过切口平移聚合将所述茎-环寡核苷酸的一条链从所述第一条形码结 合的核酸分子中置换，以形成带第一条形码的核酸分子；使引物与所述带第一条形码的核 酸分子退火，所述引物包括与所述带第一条形码的核酸分子互补的第一部分和包含第二条 形码的第二部分；以及使退火的引物延伸以形成带双重条形码的核酸分子，所述带双重条 形码的核酸分子包含所述第二条形码、所述第一条形码、以及所述核酸分子的至少一部分。 在一些方面，所述引物的第一部分与所述第一条形码或所述第一条形码的一部分退火。在 其它方面，所述引物的第一部分不在所述第一条形码内退火。可以通过使用聚合酶，例如经 由聚合酶链反应或PCR来进行延伸。所述核酸分子可以是基因组DNA、cDNA、扩增的DNA、核 酸文库、或其片段。
[0008] 在本发明的一个实施方案中，存在一种制备核酸分子的方法，所述方法包括：提供 双链核酸分子；以及使茎-环寡核苷酸的一条链与所述双链核酸分子附接以产生寡核苷酸 附接的核酸分子，所述茎-环寡核苷酸包含反向重复序列和环。在一些实施方案中，所述双 链核酸分子可以是双链DNA分子。在具体实施方案中，所述附接被进一步限定为使所述寡 核苷酸与所述双链核酸分子在所述寡核苷酸附接的核酸分子中产生非共价接合的条件下 附接，所述非共价接合如切口、缺口或5'端侧翼结构（flap structure)。在本发明的具体 方面，所述附接被进一步限定为连接（ligating)。连接可以被限定为使所述莖-环寡核苷 酸衔接子的3'端与所述靶核酸分子的5'端连接。所述方法可以进一步包括通过链置换或 通过切口平移聚合将所述寡核苷酸的一条链从所述寡核苷酸附接的核酸分子中置换。在一 个具体实施方案中，诸如通过例如聚合酶链反应、RNA转录、或链置换使所述寡核苷酸附接 的核酸分子的至少一部分扩增。本发明的方法可以进一步包括使与寡核苷酸附接的核酸分 子扩增，其中所述茎-环衔接子的分子内反向重复序列的至少一部分被排除在扩增的寡核 苷酸附接的核酸分子之外。
[0009] 连接实施方案可以被进一步限定为包括：在所述双链核酸分子上产生可连接的末 端；在所述茎-环寡核苷酸上产生可连接的末端；以及使所述茎-环寡核苷酸的可连接的 末端的一条链与所述核酸分子的末端的一条链连接，从而在所述寡核苷酸附接的核酸分子 中产生非共价接合，如切口、缺口、或5'端侧翼结构。在另外的方面，所述方法包括在所述 核酸分子上产生平末端；在所述茎-环寡核苷酸上产生平末端；以及使所述茎-环寡核苷 酸的平末端的一条链与所述核酸分子的平末端的一条链连接，从而在所述寡核苷酸连接的 核酸分子中产生切口。
[0010] 在一些方面，所述方法可以包括使茎-环寡核苷酸衔接子的一条链与靶核酸分子 的每一端连接。在一些方面，与靶核酸分子的每一端连接的茎-环衔接子的反向重复序列 可以包含相同的序列。在这个方面，所述茎-环衔接子与所述靶核酸分子的每一端的结合 将产生包含末端反向重复序列的核酸分子，从而允许所述分子形成茎环。在其它方面，与靶 核酸分子的每一端结合的茎-环衔接子的反向重复序列可以不包含相同的序列。在这个方 面，使所述茎-环衔接子与所述靶核酸分子的每一端结合将产生缺乏末端反向重复序列的 核酸分子并且因此所述分子将不能形成茎环。
[0011] 在另外的实施方案中，所述寡核苷酸附接的核酸分子包含具有3'端羟基的切口， 其中存在从所述寡核苷酸附接的核酸分子的至少一部分的3'端羟基进行的聚合。
[0012] 链置换或切口平移聚合可以被进一步限定为在环中或邻近于环的茎区域中的不 可复制碱基或区域处停止的聚合。
[0013] 在本发明的一个具体方面，所述方法进一步包括以下步骤：使用核酸内切酶对双 链DNA分子进行消化以产生DNA片段，其中所述寡核苷酸变成与所述DNA片段的一条链连 接，并且其中通过使寡核苷酸连接的DNA片段进行在环中或邻近于环的茎区域中的碱基 或序列处停止的链置换或切口平移聚合，所述寡核苷酸连接的DNA片段的聚合排除所述 茎-环衔接子的分子内反向重复序列的至少一部分。
[0014] 在一些实施方案中，所述茎-环寡核苷酸被进一步限定为包含可裂解的碱基。具 体来说，在一些情况下，所述可裂解的碱基存在于寡核苷酸的环中或邻近于环的茎的序列 中。可裂解的碱基或序列可以包含与糖-磷酸骨架或碱基附接的脱碱基位点或序列、六乙 二醇和/或庞大的化学部分。在具体实施方案中，所述脱碱基位点或序列是通过单一溶液 中的一种或多种酶而引入的。在另一个具体的实施方案中，所述茎-环寡核苷酸的环包含 至少一个脱氧尿苷。
[0015] 在具体方面，所述茎-环寡核苷酸的5'端缺少磷酸酯。
[0016] 条形码还被称为"条码"，可以基于选择特定的核酸序列而产生。举例来说， Illumina?测序可以利用6个碱基以有效地产生48种不同的条形码。Ion Torrent测序仪 (例如Ion Proton?测序仪或Ion PGM?测序仪）可以利用6个碱基产生16种条形码。在一 些实施方案中，可以应用规则以产生如下的条形码，所述条形码允许即使在测序期间出现 两处错误也可以正确地鉴定不同的条形码。条形编码描述于例如美国专利7, 902, 122和美 国专利公开2009/0098555中。可以使用U. S. 5, 935, 793或US 2010/0227329中所述的方法 通过引物延伸，例如经由PCR，来掺入条形码。在一些实施方案中，可以经由使用连接将条形 码掺入到核酸