确定体细胞突变原因的方法

确定体细胞突变原因的方法
【专利说明】确定体细胞突变原因的方法 技术领域 本发明通常涉及确定诱变剂引起的核酸分子靶向体细胞突变已经发生的可能性的方 法，和确定诱变剂是核酸分子的靶向体细胞突变的原因的可能性的方法。本发明还涉及受 试者患癌症的诊断方法和/或确定受试者患或将患癌症的可能性，治疗癌症患者或癌症高 危人群的方法。在另一方面，本发明涉及识别核酸分子基序的方法，此基序被诱变剂识别或 靶向。 相关申请 本申请要求2012年11月5日提交的题为"体细胞突变相关疾病的诊断方法"的澳大 利亚临时申请2012904826 ;2012年11月13日提交的题为"体细胞突变相关疾病的诊断方 法和数据库系统"的澳大利亚临时申请2012904940和2013年4月12日提交的题为"少量 体细胞突变的诱变相关疾病的诊断方法"的澳大利亚临时申请2013901253的优先权。澳大 利亚临时申请2012904826, 2012904940和2013901253的主题通过引用的方式整体并入本 文。 【背景技术】 正常细胞发展成癌细胞受多种因素的影响，包括免疫系统，激素状态，基因表达和组织 间的信号的改变。癌症的发展的一个特别重要的因素是体细胞突变，它在大多数（如果不 是全部）组织类型的癌症中作用。 各种基因体细胞突变的累积与癌症的发展直接相关。这已经通过体细胞突变增加的 各种动物模型证明，例如，受损的DNA聚合酶的校对或DNA修复与加速肿瘤进展相关（参 加例如 Venkatesan et al. (2007) .Mol. Cell. Biol. 27:7669-7682 ;and Albertson (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 17101-17104)。各种基因体细胞突变的增加的与多种癌 症有关。例如，在TP53基因的体细胞突变是癌症中最常见的基因变异。几乎所有类型的癌 症有TP53体细胞突变，从突变率为38% -50%卵巢癌，食管癌，结肠直肠癌，头颈癌，喉癌 和肺癌，到突变率为5%的初级白血病，肉瘤，睾丸癌，恶性黑色素瘤，和子宫颈癌，和晚期或 侵袭性癌症亚型（如三阴性或HER2扩增的乳腺癌），都与TP53体细胞突变频率增加有关 (reviewed in Olivier et al. (2010)Cold Spring Harb Perspect Biol2:a001008)。与 癌症相关的体细胞基因突变积累包括，例如，BRAF，RAS，KRAS2和NRAS，虽然癌症体细胞获 得性突变在线数据库cosmic包括25000多个基因。 环境因素可引起体细胞突变，例如香烟烟雾、紫外线和辐射，和/或生物因子或进程， 如染色体易位，DNA错配修复或未修复和酶启动体细胞超突变（SHM)。确定体细胞突变的原 因和范围不仅可以帮助诊断与体细胞突变相关的条件或预测开发这样条件的风险，而且还 可以协助发展最合适的治疗或预防方案。因此，需要精确的方法确定体细胞突变的存在和 哪些诱变剂引起受试者体细胞突变。
【发明内容】
本发明部分基于确定诱变剂导致核酸分子一个特定密码子背景发生体细胞突变的偏 好。因此，尽管已经知道一些诱变剂作用于基序，如本文所述这些基序的诱变主要发生在一 个特定密码子背景，这一过程本文称靶向体细胞突变。通过识别所述基序的密码子背景，本 发明人已经制定了用于确定所述类型的靶向体细胞突变已经发生的方法和确定一个或多 个特定诱变剂是核酸分子的靶向体细胞突变的原因的方法。已经建立了。通过评定靶向体 细胞突变的实例确定确定诱变剂靶向的基序的通用方法并在本文描述。 因为体细胞突变的累积与癌症的发生与发展与体细胞突变的累积有关，本文已经确定 了诊断受试者患癌症和/或确定受试者已经或将患癌症的可能性的方法。通过确定致病诱 变剂和/或诊断癌症或癌症发生的可能性，制定适当和具体的治疗方案抑制或减少诱变剂 的活性，和/或治疗或预防癌症。 因此，在一个方面，本发明是针对用于检测或确定诱变剂引起的核酸分子靶向体细胞 突变已经发生的方法，包括分析所述核酸分子的序列，以确定一个或多个基序密码子背景 突变的突变类型，其中，当核酸分子密码子一个位点突变的数量或百分比高于预期时，可以 定确靶向体细胞突变已经发生或可能发生。 通常，通过假设密码子背景的单独突变计算突变的预期数量或百分比。在一些实施方 案中，突变的预期百分比大约是11%或17%，和/或突变的预期数量大约是每9个突变有1 个或每6个突变有1个。在一些实例中，突变的百分比为至少30 %，35 %，40 %，45 %，50 %， 55%，60%，65%，70%，80%，85%，90%，95% 或更多。 确定诱变剂引起的靶向体细胞突变是否已经发生的方法还包括确定哪个诱变剂是靶 向体细胞突变的原因。诱变剂选自，例如，黄曲霉毒素，4-氨基联苯，马兜铃酸，砷化合物， 石棉，硫唑嘌呤，苯，联苯胺，铍和铍的化合物，1，3-丁二烯，二甲基磺酸1，4_ 丁二醇酯，镉 和镉化合物，苯丁酸氮芥，1_(2_氯乙基）-3-(4_甲基环己基）-1_亚硝基脲（MeCCNU)，二 氯二甲醚和工业级氯甲基甲醚，铬六价铬化合物，煤焦油沥青，煤焦油，焦炉逸散物，环磷酰 胺，环孢菌素A，己烯雌酚（DES)，毛沸石，环氧乙烷，甲醛，美法仑，长波紫外线联合甲氧沙 林（PUVA)，芥子气，2-萘胺，中子，镍化合物，氡，结晶二氧化硅（可吸入粒度），太阳辐射， 煤烟，：含有硫酸的强无机酸酸雾，他莫昔芬，2, 3, 7,8_四氯双苯环二恶英（TCDD)，塞替 派，二氧化钍，烟草烟雾，氯乙烯，紫外线辐射，木肩，X射线，伽玛辐射，活化诱导胞苷脱氨酶 (AID)，载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白（APOBEC)胞苷脱氨酶，和易错DNA聚合酶。 在一些实例，APOBEC 胞苷脱氨酶选自 APOBEC l、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、 APOBEC3F、APOBEC3G 和 APOBEC3H。 在特定的实施例中，所述诱变剂选自AID，APOBEC1，APOBEC3G，APOBEC3H和黄曲霉毒 素如果在核酸分子非转录链密码子第二位点（MC-2位点）GYW基序的G>A突变的数量或百 分比高于预期，可以确定AID是靶向体细胞突变的一个可能的原因；如果核酸分子非转录 链密码子第一位点（MC-1位点）WRC基序的C>T突变的数量或百分比高于预期，可以确定 AID是靶向体细胞突变的一个可能的原因；如果核酸分子非转录链密码子MC-2位点CG基 序的G>A突变的数量或百分比高于预期，可以确定APOBEC3G是靶向体细胞突变的一个可能 原因；如果核酸分子非转录链密码子MC-1位点CG基序的C>T突变的数量或百分比高于预 期，可以确定APOBEC3G是靶向体细胞突变的一个可能原因；如果核酸分子非转录链密码子 MC-1位点CC基序的C>T突变的数量或百分比高于预期，可以确定APOBEC3G是靶向体细胞 突变的一个可能原因；如果核酸分子非转录链密码子MC-1位点GA基序的G>A突变的数量 或百分比高于预期，可以确定AP0BEC3H是靶向体细胞突变的一个可能原因；如果核酸分子 非转录链密码子MC-1位点CA基序的C>T突变的数量或百分比高于预期，可以确定AP0BEC1 是靶向体细胞突变的一个可能原因；如果核酸分子非转录链密码子MC-2位点TG基序的 G>A突变的数量或百分比高于预期，可以确定AP0BEC1是靶向体细胞突变的一个可能原因； 如果核酸分子非转录链密码子MC-3位点GG基序的G>T突变的数量或百分比高于预期，可 以确定黄曲霉毒素是靶向体细胞突变的一个可能原因；其中所述核酸分子来自受试者的生 物样品。 确定靶向体细胞突变是否发生的方法的实施方案还包括确定AID相关的突变过程是 否可以引起所述靶向体细胞突变。例如，如果在核酸分子非转录链密码子MC-2位点WA基 序的A>G突变，MC-2位点GYW基序的G>A突变或MC-1位点WRC基序的C>T突变的数量或 百分比高于预期，可以确定AID相关的突变过程是靶向体细胞突变的一个可能原因。 在本发明方法的具体例子中，如果确定AID是靶向体细胞突变的一个可能原因，该方 法还包括对受试者施用AID抑制剂；如果确定AP0BEC3G是靶向体细胞突变的一个可能原 因，该方法还包括对受试者施用AP0BEC3G抑制剂；如果确定AP0BEC3H是靶向体细胞突变的 一个可能原因，还包括对受试者施用AP0BEC3H抑制剂；如果确定AP0BEC1是靶向体细胞突 变的一个可能原因，还包括对受试者施用AP0BEC1抑制剂。 在进一步的实施方案中，如果确定靶向体细胞突变已经发生和/或诱变剂是靶向体 细胞突变的可能原因，所述方法还包括在受试者中诊断癌症或确定受试者将患癌症的可能 性。 在其它方面，本发明涉及确定受试者已患或将患癌症的可能性的方法，包括分析取自 受试者生物样品的核酸分子，以检测一个或多个诱变剂是否引起靶向体细胞突变，并确定 发生靶向细胞诱变的受试者很可能已经患或发展成癌症。 在一个实例中，检测靶向体细胞突变的时机：核酸分子非转录链密码MC-2位点GYW基 序的G到A突变的数量或百分比高于预期；核酸分子非转录链密码子MC-1位点WRC基序的 C>T突变的数量或百分比高于预期；核酸分子非转录链密码子MC-2位点CG基序的G>A突 变的数量或百分比高于预期；核酸分子非转录链密码子MC-1位点CG基序的C>T突变的数 量或百分比高于预期；核酸分子非转录链密码子MC-1位点CA基序的C>T突变的数量或百 分比高于预期；在核酸分子非转录链密码子MC-1位点GA基序的G>A突变的数量或百分比 高于预期；核酸分子非转录链密码子MC-2位点TG基序的G>A突变的数量或百分比高于预 期；核酸分子非转录链密码子MC-3位点GG基序的G>T突变的数量或百分比高于预期；核酸 分子非转录链密码子MC-1位点CC基序的C>T突变的数量或百分比高于预期；或核酸分子 非转录链密码子MC-2位点WA基序的A>G突变的数量或百分比高于预期。 在具体的实例中，权利要求19所述的方法，如核酸分子非转录链密码子MC-2位点GYW 基序的G>A突变或MC-1位点WRC基序的C>T突变的数量或百分比高于预期，确定所述诱变 剂是AID ;如果核酸分子非转录链密码子MC-2位点CG基序的G>A突变，MC-1位点CG基序 的C>T突变或MC-1位点CG基序的C>T突变的数量或百分比高于预期，其中所述诱变剂是 AP0BEC3G ;如果核酸分子非转录链密码子MC-1位点CA基序检测的C>T突变或MC-2位点TG 基序的G>A突变的数量或百分比高于预期，所述诱变剂是AP0BEC1。如果核酸分子非转录链 密码子MC-1位点GA基序的G>A突变的数量或百分比高于预期，所述诱变剂是AP0BEC3G。 如果核酸分子非转录链密码子MC-3位点GG基序的G>T突变的数量或百分比高于预期，所 述诱变剂是黄曲霉毒素。 所述生物样品包括乳腺、前列腺、肝、结肠、胃、胰腺、皮肤、甲状腺、子宫颈、淋巴、造血、 膀胱、肺、肾、直肠、卵巢、子宫和头颈部的组织或细胞，并且，在一些情况下，所述癌症选自 乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、甲状腺癌、子宫颈癌、淋巴癌、血癌、 膀胱癌、肺癌、肾癌、直肠癌、卵巢癌、子宫癌和头颈部癌。在具体的实例中，所述癌症是肝细 胞癌，黑素瘤或腺样囊性癌。 本发明的一些实施方案中，如果所述样品包括前列腺组织或细胞，可以诊断受试者患 有前列腺癌或确定受试者可能已经患或将患癌症。在其他实施方案中，如果所述样品包括 乳腺组织或细胞，可以诊断受试者患有乳腺癌或确定受试者可能患或将患乳腺癌。 本发明的方法还包括治疗受试者，例如，放射疗法，外科手术，化疗，激素消融治疗， 促凋亡疗法和/或免疫疗法。在具体的实例中，所述方法包括对受试者施用AID抑制剂、 AP0BEC3G抑制剂、AP0BEC1抑制剂和/或AP0BEC3H抑制剂。 在另一个方面，本发明涉及通过诱变剂靶向识别核酸基序的方法，包括分析核酸分子 的序列，以确定诱变剂引起的基因突变是体细胞突变；确定突变的密码子背景，以识别发生 突变高于预期频率的优选核苷酸位点；并且识别位于优选核苷酸位点的核苷酸侧翼突变， 以便识别所述突变的共同基序。 本发明涉及识别针对诱变剂的核酸基序的方法，包括：分析核酸分子的序列，以确定所 述核酸分子的体细胞突变；识别密码子优选核苷酸位点上高于预期频率的突变型；并且识 别位于优选核苷酸位点的核苷酸侧翼突变，以便识别所述突变的共同基序。 所述突变类型选自 C>T、C>A、C>G、G>T、G>A、G>C、A>T、A>C、A>G、T>A、T>C 和 T>G 突，所 述优选核苷酸位点选自MC-1，MC-2和MC-3。 在此类方法中，通过假设密码子背景的单独突变计算所述预期频率。例如，所述预期频 率大约是每9个突变有1个或每6突变有1个。在一些实施方案中，所述突变发生在优选核 苷酸位点的至少有 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、85%、90%、 95%或更多。 本发明方法的一些实施方案中，分析所述核酸分子的非转录链。 所述诱变剂对于获得核酸的细胞来说是内源性的或外源性的。例如，所述诱变剂选 自：4_氨基联苯，马兜铃酸，砷化合物，石棉，硫唑嘌呤，苯，联苯胺，铍和铍化合物，1，3- 丁 二烯，二甲基磺酸1，4_ 丁二醇酯，镉和镉化合物，苯丁酸氮芥，1-(2_氯乙基）-3-(4_甲基 环己基）-1_亚硝基脲（MeCCNU)，二氯二甲醚和工业级氯甲基甲醚，铬六价铬化合物，煤焦 油沥青，煤焦油，焦炉逸散物，环磷酰胺，环孢菌素A，己烯雌酚（DES)，毛沸石，环氧乙烷，甲 醛，美法仑，长波紫外线联合甲氧沙林（PUVA)，芥子气，2-萘胺，胞苷脱氨酶，和易错DNA聚 合酶。本发明方法的具体例子中，所述核酸分子或获得核酸分子的细胞，在分析之前，已经 暴露于诱变剂。 在本发明方法的实施案中还包括第一次分离核酸分子和/或核酸分子的全部或部分 测序。所述核酸分子包含全部或部分单基因或单基因cDNA ;或包含全部或部两个或多个 基因或两个或多个基因cDNA。在一些情况下，所述基因与癌症相关。例如，所述基因选自 TP53、PIK3CA、ERBB2、DIRAS3、TET2和一氧化氮合酶（NOS)基因。在进一步的实施方案中， 分析构成细胞全外显子或全基因组的核酸分子。 本发明涉及一种试剂盒，包含在本文所述的方法中使用的试剂。所述试剂选自，例如， 引物、dNTP和聚合酶。 在本发明方法具体实施方案中，所述方法的全部或部分由处理系统执行。 【附图说明】 图1示出核酸分子非转录链相关区域的靶向体细胞突变。 图2示出核酸分子示范性的分析过程，以确定AID或A0PBEC3G引起的靶向体细胞突变 是否发生。 图3示出的分析用于确定突变是随机发生还是靶向体细胞突变的结果。 图4示出子宫颈癌受试者核酸TP53基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点 (AP0BEC3G)，TG/CA位点（AP0BEC1)和WA位点突变的密码子内的频率和位置，并且示出突变 发生的统计分析。 图5示出结肠癌受试者核酸TP53基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点（AP0BEC3G)，TG/ CA位点（AP0BEC1)和WA位点突变的密码子内的频率和位置，并且示出突变发生的统计分 析。 图6示出肝细胞癌受试者核酸TP53基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点 (AP0BEC3G)，TG/CA位点（AP0BEC1)，WA位点和GG位点（黄曲霉毒素）突变的密码子内的 频率和位置，并且示出突变发生的统计分析。 图7示出胰腺癌受试者核酸TP53基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点（AP0BEC3G)，TG/ CA位点（AP0BEC1)和WA位点突变的密码子内的频率和位置，并且示出突变发生的统计分 析。 图8示出前列腺癌受试者核酸TP53基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点 (AP0BEC3G)，TG/CA位点（AP0BEC1)和WA位点突变的密码子内的频率和位置，并且示出突变 发生的统计分析。 图9示出恶性黑色素瘤受试者核酸TP53基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点 (AP0BEC3G)，TG/CA位点（AP0BEC1)和WA位点突变的密码子内的频率和位置，并且示出突变 发生的统计分析。 图10示出宫颈腺癌受试者核酸TP53基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点 (AP0BEC3G)，TG/CA位点（AP0BEC1)和WA位点突变的密码子内的频率和位置，并且示出突变 发生的统计分析。 图11示出宫颈腺癌受试者核酸N0S基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点 (AP0BEC3G)，TG/CA位点（AP0BEC1)和WA位点突变的密码子内的频率和位置，并且示出突变 发生的统计分析。 图12示出乳腺癌受试者核酸PI 3CA基因GYW/WRC位点（AID)，CG/CG位点 (AP0BEC3G)，TG/CA