一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的多重rt-pcr方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪场环境中主要病毒污染监测的多重RT-PCR技术，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]养猪业逐渐向集约化、规模化发展，密集型饲养方式是当前主要的养殖模式，猪传染病主要以环境中的空气、饲料、饮水、器具、粪便等作为媒介进行传播。猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等是污染规模化猪场的主要病毒。现有的技术主要用于猪发病后的诊断，而缺乏对环境中病毒污染的监测技术，更不能建立预警机制，不能提前防控病毒感染，也不能监测猪场病原的净化情况。因此，建立猪场环境中上述6种病毒污染多重RT-PCR监测方法，监测猪舍和猪场环境中空气、饲料、饮水、器具、粪便和猪群的上述6种病毒污染，为建立猪场环境中主要病毒污染预警机制及主要病毒病防控和净化体系提供了技术支持。
[0003]
【发明内容】
:
本发明的目的是提供一种测试效果好，使用方便的一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的多重RT-PCR方法和应用。
[0004]本发明的技术方案是，1、一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的方法，其特征在于包括以下步骤:
I)引物设计利用软件在猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)保守区进行引物设计。
[0005]CSFVF GCTCCCTGGGTGTTCTAAGT CSFVR TGCTGTCCTTCTCATGCTCTT PRRSVF GGCCAGCCAGTCAATCAG PRRSVR GGCAAACTAAACTCCACAGTG JEVF CAAACTGGCTCTGAAAGG
JEVR TGTCTCAGGTCCATCTACG PCV-2F CAGCACCCTGTAACGTTTG PCV-2R AGGAGTACCATTCCAACGG PPVF ACATCTAAATATGCCAGAACACG PPVR GTTTGCCATGAGTGAGTTAATTT PRVF CTCCTTGAGCGTCTTCGTCG PRVR CCTTCCTGTCCAACCCCTTC
把对应片段连接到载体并转化到大肠杆菌中，获得大量扩增后，按照1:5的比例将保护剂和DNA混合均勾，制成专用marker，作为参照标准。
[0006]2)多重RT-PCR的建立建立了一个体系同时检测上述6种病毒的多重RT-PCR方法。
[0007]3)空气样品采集通过液体撞击法采集猪舍内和猪场环境中空气；用截留分子量为1kD的超滤管超滤离心对病毒进行分离浓缩。
[0008]该监测方法所涉及6种病毒(CSFV、JEV、PRRSV, PCV-2、PRV和PPV)的目的片段分别为 829bp、1045 bp、275 bp、382 bp、142 bp 和 636bp。
[0009]该多重RT-PCR采用50 μ L反应体系:2 X TaqMaster Mix为25 μ L，6种病毒混合引物(20μΜ/1)共3 μ L，6种病毒混合核酸共3 μ L，灭菌蒸馏水19 μ L0反应条件为:94 °C5min ；94 °C 45s ；56 °C lm30s ； 72 °C 50s 循环数为 40 次，最后 72 °C延伸 10min，4 °(:保存。
[0010]猪舍和猪场环境中空气样品采集的位置和点数为:猪舍内采集样品的位置为猪舍过道中央距离地面高度0.5-lm处根据猪舍的面积确定采样点数，30m2左右I个采样点，猪场内采集样品的位置为猪场中央及院墙周围四个角落共5个采样点，距离地面0.5-lm，每个采样点采集时间为40min，猪场外采集样品的位置为猪场上、下风口距离200m处各3个采样点。粪便采集选用早晨喂食后采集新鲜的粪便样品20g左右。
[0011]该方法可用于监测猪舍和猪场环境中空气、饲料、饮水、器具、粪便和猪群的上述6种病毒污染，为建立猪场环境中主要病毒污染预警机制及主要病毒病防控和净化体系提供了技术支持。
[0012]本发明的发明思路是:
1.根据Genbank的序列，通过DNAstar比对分析其保守序列，针对其保守序列设计引物。
[0013]2.获取猪瘟病毒(CSFV)、细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒-2型(PCV-2)、猪繁殖呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的参考毒株，
3.提取病毒的核酸，进行单项的PCR和RT-PCR，并将其连接到pMD-18 T载体，将其转入感受态细胞内保存，提取质粒，进行PCR扩增后，胶回收各个片段测定浓度并稀释至其相应浓度，按照1:5的比例将保护剂和DNA混合均匀，制成专用marker。
[0014]4.通过液体撞击法采集猪舍和猪场内外环境中空气，用截留分子量为1kD的超滤管离心对病毒进行分离浓缩，其他样品如饲料、饮水、器具、粪便和猪群的采样方法采用常规的收集方法，浓缩方法相同。
[0015]5.多重RT-PCR，采用50 μ L反应体系:2 X Taq MasterMix为25 μ L，6种病毒混合引物(20μΜ/1)共3 μ L，6种病毒混合核酸共3 μ L，灭菌蒸馏水19 μ L0反应条件为:94°C5min ；94°C 45s ；56°C lm30s ； 72°C 50s 循环数为 40 次，最后 72°C延伸 10min，4°C保存。
[0016]6.通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，用I X TAE缓冲液、I1V电压、室温条件下电泳时间30min左右，当loading Buffer达到胶的中间位置即可，电泳后与专用marker进行比对，出现相应条带，判定为阳性。
[0017]7.任一个样品检测结果为阳性，即可判定该场受到病毒污染威胁，提示该猪场应采取相应防控措施。
[0018]8.预警机制:猪场外上、下风口任何一个样品检出病毒阳性，而猪场、猪舍内样品为阴性，为一级预警；猪场内任何一个样品检出病毒阳性，而猪舍内样品为阴性，或疫苗免疫排毒期猪舍内疫苗毒为阳性，为二级预警；非疫苗免疫排毒期猪舍内空气、饲料、饮水、器具的任何一个样品检出病毒阳性，而同栋猪舍的猪群或粪便样品为阴性，为三级预警；非疫苗免疫排毒期在猪群或粪便的任何一个样品检出病毒阳性，为四级预警。
[0019]【附图说明】:
图1是本发明的反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定的图。
[0020]图面说明:图1琼脂糖凝胶检测JEV、CSFV, PRRSV, PPV、PCV-2、PRV 6病毒的多重PCR 结果，M:DL2000 DNA Marker ；1:专用 Marker 2:JEV, CSFV，PRRSV，PPV，PCV-2, PRV 多重 RT-PCR, 3 JEV, 4:CSFV，5:PPV，6:PCV-2, 7:PRRSV，8:PRV0
[0021]【具体实施方式】:
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制，对本发明方法、步骤或者条件的修改或者替换，均属于本发明的范围。
[0022]下面实施例来进一步详细说明本发明。
[0023]实施例1、专用Marker的制备
本发明利用Genbank的参考序列，进行序列比较，选择保守序列，利用生物信息技术针对各个序列设计引物，提取病毒的核酸，进行PCR或RT-PCR，并胶回收PCR产物，将其连接到pMD-18T载体，将其转化到DH5a感受态细胞中保存，以重组质粒为模板进行PCR扩增，胶回收各个片段，测定其浓度，将其稀释至相应浓度添加保护剂(36%甘油，0.05%的溴酚蓝，
0.05% 二甲苯腈蓝FF，30mM的EDTA)。并按保护剂和DNA的比例为1:5混合均匀，即制成专用 Marker。专用 Marker 由 DNA 片段 1045bp、829bp、636bp、382bp、275bp 和 142bp 组成，共六条带，其中636bp条带的DNA量为30ng/^L，其余条带为10 ng/^L。在_20°C保存一年，避免反复冻融。
[0024]实验例2、6种病毒多重RT-PCR方法
将提取PCV-2、PPV、PRV的DNA和JEV、CSFV, PRRSV的cDNA混合作为模板进行多重RT-PCR的检测，多重PCR采用50 μ L的反应体系:2XTaq MasterMix为25 μ L，6种病毒混合引物(20μΜ/1)共3 μ L，6种病毒混合核酸共3 μ L，灭菌蒸馏水19 μ L0瞬时离心混合均匀。反应条件为:94°C 5min ；94°C 45s ；56°C lm30s ； 72°C 50s 循环数为 40 次，最后 72°C延伸10min，4°C保存。反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0025]实验例3、猪场环境的监测
将便携式气体采样栗和气泡收集瓶相连，收集瓶内加入20 mL pH=7.2的PBS缓冲液(含5%甘油)，工作流量为6 L/min，收集时间为30min，样品在24小时内处理完毕。