>[0026]空气样品浓缩采用超滤的方式进行浓缩，将上述收集液加入截留分子量为(1kD)的超滤管中，在4°C条件下7000rpm离心30min，将浓缩液再进行1000rpm离心lOmin，取上清提取核酸，进行多重RT-PCR检测。
[0027]粪便、饲料样品称取样品5g，加入15mL的0.1M PBS液，涡旋制成悬液后，4°C，3000r/min离心lOmin，取上清，上清10000r/min离心30min，取上清；器具、猪群取拭子洗脱液，10000r/min离心30min，取上清；饮水取20mL，10000r/min离心30min，取上清。浓缩方法与上述空气样品的浓缩方法相同。用多重RT-PCR方法检测样品。
[0028]监测空气样品113份，粪便样品86份，多重RT-PCR与单项PCR结果检测比较，符合率均为100%。
[0029]
后附序列表序列表
<110>河南科技学院
〈120〉一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的方法 〈130〉 2015 〈160〉 12
<170> PatentIn vers1n 3.3 〈210〉 I 〈211〉 18 〈212〉 DNA
〈213〉日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus , JEV)
〈400〉 I
caaactggct ctgaaagg18
〈210〉 2 〈211〉 19 〈212〉 DNA
〈213〉日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus , JEV)
〈400〉 2
tgtctcaggt ccatctacg19
〈210〉 3 〈211〉 20 〈212〉 DNA
〈213〉猪痕病毒(Classical swine fever virus)
〈400〉 3
gctccctggg tgttctaagt20
〈210〉 4 〈211〉 21 〈212〉 DNA
〈213〉猪痕病毒(Classical swine fever virus)
〈400〉 4
tgctgtcctt ctcatgctct t21
〈210〉 5 〈211〉 18 〈212〉 DNA
〈213〉猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus)
〈400〉 5 ggccagccag tcaatcag18
〈210〉 6 〈211〉 21 〈212〉 DNA
〈213〉猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus)
〈400〉 6
ggcaaactaa actccacagt g21
〈210〉 7 〈211〉 23 〈212〉 DNA
〈213〉猪细小病毒(porcine parvovirus)
〈400〉 7
acatctaaat atgccagaac acg23
〈210〉 8 〈211〉 23 〈212〉 DNA
〈213〉猪细小病毒(porcine parvovirus)
〈400〉 8
gtttgccatg agtgagttaa ttt23
〈210〉 9 〈211〉 19 〈212〉 DNA
〈213〉猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus type 2)
〈400〉 9
cagcaccctg taacgtttg19
〈210〉 10 〈211〉 19 〈212〉 DNA
〈213〉猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus type 2)
〈400〉 10
aggagtacca ttccaacgg19
〈210〉 11 〈211〉 20 〈212〉 DNA
〈213〉伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)
〈400〉 11
ctccttgagc gtcttcgtcg20
〈210〉 12〈211〉 20〈212〉 DNA
〈213〉伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)
〈400〉 12
ccttcctgtc caaccccttc20。
【主权项】
1.一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)引物设计利用软件在猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)保守区进行引物设计； CSFVF GCTCCCTGGGTGTTCTAAGT CSFVR TGCTGTCCTTCTCATGCTCTT PRRSVF GGCCAGCCAGTCAATCAG PRRSVR GGCAAACTAAACTCCACAGTG JEVF CAAACTGGCTCTGAAAGG JEVR TGTCTCAGGTCCATCTACG PCV-2F CAGCACCCTGTAACGTTTG PCV-2R AGGAGTACCATTCCAACGG PPVF ACATCTAAATATGCCAGAACACG PPVR GTTTGCCATGAGTGAGTTAATTT PRVF CTCCTTGAGCGTCTTCGTCG PRVR CCTTCCTGTCCAACCCCTTC 把对应片段连接到载体并转化到大肠杆菌中，获得大量扩增后，按照1:5的比例将保护剂和DNA混合均勾，制成专用marker，作为参照标准； 2)多重RT-PCR的建立建立了一个体系同时检测上述6种病毒的多重RT-PCR方法； 3)空气样品采集通过液体撞击法采集猪舍内和猪场环境中空气；用截留分子量为1kD的超滤管超滤离心对病毒进行分离浓缩。2.根据权利要求1所述的一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的方法，其特征在于:该监测方法所涉及6种病毒(CSFV、JEV、PRRSV, PCV-2、PRV和PPV)的目的片段分别为 829bp、1045 bp、275 bp、382 bp、142 bp 和 636bp。3.根据权利要求1所述的一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的方法，其特征在于:该多重RT-PCR采用50 μ L反应体系:2XTaqMaster Mix为25 μ L，6种病毒混合引物(20μΜ/1)共3 μ L，6种病毒混合核酸共3 μ L，灭菌蒸馏水19 μ L，反应条件为:94 °C5min ；94 °C 45s ；56 °C lm30s ； 72 °C 50s 循环数为 40 次，最后 72 °C延伸 10min，4 °(:保存。4.根据权利要求1所述的一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的方法，其特征在于:猪舍和猪场环境中空气样品采集的位置和点数为:猪舍内采集样品的位置为猪舍过道中央距离地面高度0.5-lm处根据猪舍的面积确定采样点数，30m2左右I个采样点，猪场内采集样品的位置为猪场中央及院墙周围四个角落共5个采样点，距离地面0.5-lm，每个采样点采集时间为40min，猪场外采集样品的位置为猪场上、下风口距离200m处各3个采样点，粪便采集选用早晨喂食后采集新鲜的粪便样品20g左右。5.根据权利要求1所述的一个体系同时监测猪场环境中6种病毒污染的方法，其特征在于:该方法可用于监测猪舍和猪场环境中空气、饲料、饮水、器具、粪便和猪群的上述6种病毒污染，为建立猪场环境中主要病毒污染预警机制及主要病毒病防控和净化体系提供了技术支持。
【专利摘要】本发明提供了用一个体系同时监测猪场环境中6种主要病毒污染的多重RT-PCR方法及应用。该方法的建立是通过对猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)进行引物设计，构建针对这6种病毒的多重RT-PCR反应体系，通过液体撞击采集空气样品，采用超滤离心对病毒进行分离浓缩，建立了猪场环境中主要病毒污染检测方法。该方法可用于监测猪舍和猪场环境中空气、饲料、饮水、器具、粪便和猪群的上述6种病毒污染，为建立猪场环境中主要病毒污染预警机制及主要病毒病防控和净化体系提供了技术支持。
【IPC分类】C12Q1/70, C12R1/93, C12Q1/68
【公开号】CN105002297
【申请号】CN201510076421
【发明人】刘兴友, 魏小兵, 张秀林, 欧长波, 刘明成, 王秋霞, 贺会利, 刘长忠, 王丽荣
【申请人】河南科技学院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年2月13日