Il28b基因位点多态性检测引物组合物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及IL28B基因位点多态性检测引物组合物 和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎是严重威胁人类生命的传染病之一，目前我国约有3700万~4000万感染 者。每年的新发病例约300万~400万，其主要通过血源性途径进行传播，包括输血、性接触 传播、纹身和吸毒等。
[0003] 根据丙型肝炎病毒（HCV)基因序列的差异，可将HCV分为6个基因型（1-6)，每个 基因型又可分为不同亚型。HCV基因型分布具有明显的地域性，其中1型呈全球性分布，占 所有HCV感染者的70%以上。Ib和2a基因型在我国较为常见，其中以Ib型为主。
[0004] 目前HCV标准治疗方法是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗48周，但是对于1型 丙型肝炎的病人来说，只有42%~52%的病人可获得持续的病毒学应答，同时由于干扰素的 不良作用，导致1〇%~14%的病人被迫提前停药或减量。研究发现编码Y3干扰素（IFNY3) 的IL28B基因附近有一些单核苷酸多态位点与HCV病毒自发清除能力及对干扰素的应答有 关。当这些等位基因发生突变后，患者的HCV自发清除和对干扰素应答能力发生明显变化。 其中IL28B的860C>TSNP点基因型为C/C的患者的持续病毒学应答百分比明显高于T/T 基因型患者；此外，IL28B的917DGSNP点基因型为T/T的患者较T/G和G/G基因型患者 的持续病毒学应答率更高。
[0005] 因此，IL28B基因上的SNP位点860C>T和9m>G的基因多态性对HCV感染者标 准化治疗影响重大，通过对IL28B基因上860C>T和917DG两个SNP点基因型的检测来辅 助临床诊断，为临床医生选择药物提供参考。
[0006] 目前，检测基因位点多态性的技术手段有很多，但是大多数均停留在实验室水平， 还不能真正应用于医疗机构的日常检测中，以下介绍目前存在的检测技术： 2. 1单链构象多态性技术（PCR-SSCP) 利用点突变或SNP可以对短的DNA单链构象造成影响，从而导致电泳速度的不同来进 行检测。特点是可以进行特定区域突变的筛查，但需要跑PAGE胶，较为繁琐，并有一定的漏 检率。
[0007] 2. 2高分辨率融解曲线分析（HRM) 这是近两年发展起来的新技术，原理简便，不需要对反应条件和体系进行特别的优化， 容易实现，可进行突变的筛查，但需要特定仪器和试剂的支持。并且只能对片段内突变点进 行检测，不能确定检测突变点的具体位置，容易造成假阳性结果。
[0008] 2. 3Taqman探针法（定量PCR) 适合已知SNP位点、位点数量少、通量高的检测。但是探针合成费用价格昂贵，不能同 时发现未知SNP位点，并且容易造成假阳性结果。
[0009] 2. 4变性高效液相色谱（DHPLC) 对于特定位点的突变检测，需要摸索各种条件，稳定性较差，影响因素太多，所以不容 易做好。
[0010] 2.5限制性内切酶酶切法 根据突变或SNP位点选择合适的内切酶对PCR产物进行酶切，然后电泳鉴定。该方法 稳定可靠，但要注意酶切效率完全，而且不是所有的突变或SNP位点都有酶可以选择，容易 造成污染。
[0011] 2. 6芯片技术 与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点，仅适用于全 基因组SNP扫描，不适宜单个基因的SNP位点检测，精度低，价格昂贵。
[0012] 目前国内珠海赛乐奇生物技术有限公司的IL28B基因多态性检测试剂盒采用的 是基因芯片方法已获得认证。
[0013] 2. 7位点特异性PCR引物（ARMS) 利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等 位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现 PCR扩增带，从而检测出突变。利用Taqman探针在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA 中突变的检测，具有极高的特异性和敏感度。
[0014] 2.8直接测序法 SNP分析的金标准，由于基因序列分析法检测的是易突变区的完整序列，因此可以检测 未知突变位点。但测序实验操作较为复杂、实验周期较长、电泳容易造成实验室污染。
【发明内容】
[0015] 为了解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一组IL28B基因位点多态性检测 引物组合物。
[0016] 该IL28B基因位点多态性检测引物组合物，包括IL28B860位点检测引物和/或 IL28B917位点检测引物，其中， IL28B860位点检测引物由以下序列组成： IL28B860-F1:SEQIDN0:1 所示核苷酸序列， IL28B860-F2:SEQIDN0:2 所示核苷酸序列， IL28B860-R:SEQIDN0:3所示核苷酸序列； IL28B917位点检测引物由以下序列组成： IL28B917-F1:SEQIDN0:4 所示核苷酸序列， IL28B917-F2:SEQIDN0:5 所示核苷酸序列， IL28B917-R:SEQIDN0:6所示核苷酸序列； 其中，IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1 和IL28B917-F2 的核苷酸序列 5' 端均 标记荧光标记基团。
[0017] 等位基因特异性扩增（Allelesspecificamplification，ASA)-又称扩增阻碍突 变系统（Amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)，利用PCR引物的 3' 端末位 碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在 严格的条件下，只有在引物3'端碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。 本发明在引物IL28B860-F2和IL28B917-F2的5'端加上3个T对扩增出的片段进行区分。
[0018] 不同引物特异性结合目标片段，使得不同基因型的DNA片段得到扩增，然后对PCR 产物进行分析即可获得待检样品的基因型。
[0019] 作为优选方案，上述IL28B基因位点多态性检测引物组合物，还包括HER2内标引 物，由以下序列组成： HER2-F:SEQIDN0:7所示核苷酸序列， HER2-R:SEQIDN0:8所示核苷酸序列； HER2-F的核苷酸序列 5' 端标记与IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1 和IL28B917-F2的核苷酸序列5'端荧光标记基团显色不同的荧光标记基团。
[0020] 设计内标引物，扩增原癌基因人类表皮生长因子受体2 (HER2)片段作为内标质控 品，内标质控品与靶基因无同源性，是与靶基因没有冲突的另外分子量大小的基因。内标质 控体系用来检测反应体系可能存在的抑制因素，使上述引物检测结果更准确。
[0021] 作为优选方案，上述IL28B基因位点多态性检测引物组合物，IL28B860-F1、 IL28B860-F2、IL28B917-F1 和IL28B917-F2 的核苷酸序列 5'端标记FAM基团，HER2-F的核 苷酸序列5'端标记HEX基团。
[0022] 本发明还提供了以上任一所述的IL28B基因位点多态性检测引物组合物在制备 IL28B基因位点多态性检测试剂中的应用。
[0023] 本发明还提供了一种IL28B基因位点多态性检测试剂盒，包括以上所述的 IL28B860位点检测引物、IL28B917位点检测引物和HER2内标引物。其中，IL28B860位点 检测引物由以下序列组成： IL28B860-F1:SEQIDN0:1 所示核苷酸序列， IL28B860-F2:SEQIDN0:2 所示核苷酸序列， IL28B860-R:SEQIDN0:3所示核苷酸序列； IL28B917位点检测引物由以下序列组成： IL28B917-F1:SEQIDN0:4 所示核苷酸序列， IL28B917-F2:SEQIDN0:5 所示核苷酸序列， IL28B917-R:SEQIDN0:6所示核苷酸序列； IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1 和IL28B917-F2 的核苷酸序列 5' 端均标记 荧光标记基团。HER2内标引物由以下序列组成： HER2-F:SEQIDN0:7所示核苷酸序列， HER2-R:SEQIDN0:8所示核苷酸序列； HER2-F的核苷酸序列 5' 端标记与IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1 和IL28B917-F2的核苷酸序列5'端荧光标记基团显色不同的荧光标记基团。
[0024] 作为优选方案，上述IL28B基因位点多态性检测试剂盒中，还包括IL28B860(C/T) 阳性质控品、IL28B917 (T/G)阳性质控品、IL28B内标质控品、IL28B阴性质控品和PCR反应 液，其中，IL28B860(C/T)阳性质控品为杂合基因型IL28B860(C/T)灭活全血，IL28B917(T/G)阳性质控品为杂合基因型IL28B917(T/G)灭活全血，IL28B内标质控品为HER2基因片 段，IL28B阴性质控品为纯化水，PCR反应液包括dNTPs、Mg'TaqDNA聚合酶和UDG酶。
[0025] 阳性质控品的存在是为了验证试剂盒中的试剂是否有效。每次做实验时都要用阳 性质控品作为对照试验，当阳性质控品检测正常时，才能证明我们该次试验结果可靠。阳性 质控品选择灭活全血是因为全血保存起来更加稳定。
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