一株淡水真菌无隔节丛孢菌株及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株淡水真菌无隔节丛孢 (Arthrobotrysnonseptata)YMFl. 01852 菌株及其应用。
【背景技术】：
[0002] 植物寄生线虫是植物的重要病害之一，全球每年因植物寄生线虫病害所引起的农 作物经济损失达到780亿美元。在我国，植物寄生线虫危害烟草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花 生、中药材等几乎所有作物，成为农业生产中重要的限制因子之一。目前对植物有害的线虫 约有3000多种，在我国主要有根结线虫、胞囊线虫、松材线虫等。根结线虫是农业上危害最 大的一类线虫，据估计，在全世界农业生产每年因各类灾害造成的总损失中，根结线虫的危 害约占5%左右（1)。
[0003] 目前对线虫的防治主要依靠化学杀虫剂，但长期使用化学农药除了造成环境污 染、残留、破坏生态平衡等弊端外，同时加剧了害虫的抗药性。利用线虫天敌来进行生物防 治具有不污染环境，药效持久，害虫不易产生抗药性等优点，得到各国政府的重视。从天然 资源中寻找和发现活性杀线虫代谢物，是研发环境友好型生物杀线虫剂的重要途径（2)。我 国的水生真菌资源丰富，具有广泛的生物多样性，而对其次生代谢产物的研究很少（3, 4)， 本发明正是基于上述理论，以根结线虫和秀丽隐杆线虫为靶标，从淡水真菌代谢产物中寻 找高效杀线虫活性物质，为研究开发新型杀线虫剂寻找新的资源。
[0004] 参考文献：
[0005] 1.McCarterJP(2008)Nematology:terraincognitanomore.Nature Biotechnology26:882-884
[0006] 2.董锦艳等（2001)真菌杀线虫代谢物的研究进展.20(2)
[0007] 3.LuoJ,ZhangKQ,CaiL,KevinDH(2004)Freshwaterfungiinmainland China. 23(1)
[0008] 4.董锦艳，申开泽，孙蓉（2011)淡水真菌活性代谢产物的研究进展。30(2): 206-217
【发明内容】
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[0009] 本发明的目在于提供一株淡水真菌无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata) YMF1. 01852菌株及其应用。
[0010] 本发明筛选到的一株淡水真菌无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata) YMF1. 01852菌株已于2014年12月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏 号：CGMCCNo. 10115。
[0011] 本发明的真菌通过试管种培养后，再经常规液体发酵培养后提取制备，具体步骤 如下：
[0012] 1 ?试管种培养
[0013] 培养基配方为马铃薯琼脂（PDA)培养基，即马铃薯200g;葡萄糖20g;琼脂20g;水 1000mL〇
[0014] 2.液体发酵培养
[0015] 液体发酵培养基为马铃薯葡萄糖肉汤（PDB)培养基，即马铃薯200g;葡萄糖20g; 水 1000mL。
[0016] 将试管种接种到500mL三角瓶（每瓶装150-250mL)液体培养基中，25~28°C下， 摇床转速以130~170r?min\发酵10-16天得到发酵液。
[0017] 本发明的真淡水真菌无隔节丛抱（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852菌株在 制备防治根结线虫、秀丽隐杆线虫生物制剂中的应用。
[0018] 本发明的优点在于：用淡水真菌无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata) YMF1. 01852菌株制备的生物制剂对根结线虫和秀丽隐杆线虫具有杀线虫效果明显的特 点，具有良好的应用开发前景。
【具体实施方式】：
[0019] 首先对淡水真菌无隔节丛抱（Arthrobotrysnonseptata))YMF1. 01852菌株进行 发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行杀线虫活性试验，确定其对线虫的作用。
[0020] 实施例 1 :菌株无隔节丛抱（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852 的培养
[0021] 将无隔节丛抱（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852的菌丝体接种到试管琼 脂培养基上，培养基配方为PDA培养基，即马铃薯200g;葡萄糖20g;琼脂20g;水1000mL。 28°C培养8天，获得试管种。
[0022] 再将试管种接种到500mL三角瓶（每瓶装150mL)液体培养基中，培养基配方 为：马铃薯200g;葡萄糖20g;水1000mL，pH自然。然后在25°C或28°C下，摇床转速以 130r?min\或170r?min1发酵10天或16天得到发酵液。
[0023] 实施例2 :菌株无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852的杀线虫活 性试验
[0024] 将发酵液浓缩5倍液的基础上，依次稀释为5X、10X、20X、50X，分别对根结线 虫、秀丽隐杆线虫进行杀线虫活性试验。
[0025] 1?制备试验用制剂
[0026]将发酵液浓缩5倍液的基础上，依次稀释为5X、10X、20X、50X，分别对根结线 虫、秀丽隐杆线虫进行杀线虫活性试验。
[0027] 2?制备试验用线虫
[0028] a.制备根结线虫
[0029] 将番茄根部冲洗干净，在显微镜下挑取卵块后在28°C的无菌水中孵化。采用改进 贝尔曼漏斗法收集2龄幼虫：在漏斗里铺上60目的筛网，筛网上再铺一层面巾纸，漏斗底 部用橡胶管相连，橡胶管下连一个蓝枪头，橡胶管用夹子夹住。无菌水冲洗线虫平板2-3次 后，得到的线虫溶液转移到50um的筛网中过滤，分离得到具有活力的线虫溶液（面巾纸使 得死线虫和杂质不能过滤），4h后松开夹子收集线虫，离心后弃上清。
[0030] b.制备秀丽隐杆线虫
[0031] 挑取秀丽隐杆线虫培养物，接种至三角瓶内的无菌燕麦培养基中，28°C培养10d， 见培养基中大量线虫活动时，挑取线虫培养物放入4层擦镜纸中包好，放入盛有去离子水 的贝曼漏斗中，根据线虫的游动性及其自身的重力作用，利用漏斗下方连接的试管收集 线虫，此装置静置8-12h，收集沉积于试管底部的线虫，将线虫分装于1. 5mL的Ep管中， 5,OOOrpm，离心30sec后弃上清，并用无菌水洗涤3-5次，浓缩备用。
[0032] 3?无隔节丛抱（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852代谢物对线虫作用的试 验
[0033] 在经灭菌的16孔板中分别加入将浓缩5倍的发酵液依次稀释为5X、10X、20X、 50X的实验用发酵液各lmL，以加lmL无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中各加入50 微升线虫悬浮液（含线虫96-100条），放入28°C恒温箱中培养，每隔24小时观察一次并记 录线虫的死亡率，计算校正死亡率即为杀线虫药效。每个处理重复3次。
[0034] 线虫死亡率（％ )=(死亡线虫数/供试线虫数）X100
[0035] 校正死亡率（％ ) = [(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率V(l_对照线虫死亡 率）]X100
[0036]a?无隔节丛抱（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852代谢物对秀刚隐杆线虫 的杀线虫效果
[0037] 24小时后观察，发现大多数线虫活动变得缓慢。
[0038] 48小时后观察，发现多数线虫已死亡，实验数据如下表所示：
[0039] 无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852发酵液不同稀释倍数对秀丽 隐杆线虫的杀线虫效果
[0040]
[0041]
[0042] 结果表明，无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852代谢产物对秀丽 隐杆线虫具有良好的杀线虫活性。
[0043]b?无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852代谢物对根结线虫的杀 线虫效果
[0044] 24h后观察，发现多数线虫已经死亡，实验数据如下表所示：
[0045] 无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata)YMF1. 01852发酵液不同稀释倍数对南方 根结线虫的杀线虫效果
[0046]
[0047] 结果表明，无隔节丛孢（Arthrobotrysnonseptata)代谢产物对根结线虫具有很 好的杀线虫活性。
[0048] 通过对两种线虫的杀线虫的试验结果表明，无隔节丛孢（Arthrobotrys nons印tata)YMFl. 01852是一株具有应用价值的真菌，显示出其良好的应用开发前景。
【主权项】
1. 一株淡水真菌无隔节丛孢（Arthrobotrys nonseptata)YMFl. 01852菌株，保藏号： CGMCC No. 10115。2. 权利要求1所述的淡水真菌无隔节丛抱（Arthrobotrys nonseptata) YMFL 01852菌 株在制备防治根结线虫、秀丽隐杆线虫生物制剂中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一株淡水真菌无隔节丛孢(Arthrobotrys？nonseptata)YMF1.01852菌株及其应用，属微生物农药技术领域。本发明的淡水真菌无隔节丛孢(Arthrobotrys？nonseptata)YMF1.01852菌株已于2014年12月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏号：CGMCC？No.10115。本发明的淡水真菌无隔节丛孢(Arthrobotrys？nonseptata)YMF1.01852菌株在制备防治根结线虫、秀丽隐杆线虫生物制剂中的应用。本发明的优点在于：用淡水真菌无隔节丛孢(Arthrobotrys？nonseptata)YMF1.01852菌株制备的生物制剂对根结线虫和秀丽隐杆线虫具有杀线虫效果明显的特点，具有良好的应用开发前景。CGMCC No.1011520141208
【IPC分类】C12N1/14, A01N63/04, A01P5/00, C12R1/645
【公开号】CN105112295
【申请号】CN201510160375
【发明人】乔敏, 杨敏, 张克勤, 余泽芬, 李蕾
【申请人】云南大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年4月7日