大豆转化过程中非种系事件的早期检测和去除的制作方法

大豆转化过程中非种系事件的早期检测和去除的制作方法
【专利说明】
[0001] 优先权要求
[0002] 本申请要求 2013 年 3 月 15 日提交的题为"EARLY DETECTION AND EUMINATI0N OF NON GERM-LINE EVENTS IN THE SOYBEAN TRANSFORMATION PROCESS"的美国临时专利申 请序列号61/789, 379的申请日的权益。
[0003] 对电子提交的序列表的援引
[0004] 序列表的正式拷贝作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web电子提交，文件名 "70524SEQUENCES"，于2013年3月11日生成，大小为9千字节，并与本说明书同时提交。在 该ASCII格式文件中包含的序列是说明书的一部分，在此整体并入本申请。
技术领域
[0005] 本公开部分地涉及从由大豆非种系转化子和大豆种系转化子的组合构成的群体 中鉴定大豆种系转化子的方法。相应地，大豆非种系转化子在转化过程中被早期检出并去 除。大豆种系转化子被检出，并加以选择以培养成为成熟的大豆植物。该方法易于适用于 在转化过程的早期阶段筛选并获得大豆种系转化子。
[0006] 背景
[0007] 大豆转化方法学在过去三十年中已经得到了发展和改进。大豆转化方法学的这 种演进已经导致人们能够成功地将包含农艺性状的转基因导入大豆基因组内。1990年代 中期除草剂耐性转基因大豆事件的问世为生产者提供了一种新的、便利的控制广谱杂草的 技术革新，这在种植农业方法上是无与伦比的。目前，转基因大豆在全世界都有市售，而且 新的转基因大豆产品，例如Enlist?大豆，为日益严重的杂草问题提供了改进的解决方案。 倘若没有大豆转化方法学的开发和改进，转基因大豆在现代农艺实践中的应用是没有可能 的。开发出新的、改进的大豆转化方法学，使之能够用于检测并选择大豆种系，对于应对将 新的、复杂的农艺性状渗入大豆基因组内所需的挑战而言是至关重要的。
[0008] 在转化过程中及早鉴定并选择大豆种系转化子是优选的，因为大豆种系转化子包 含稳定整合的转基因，该转基因能够在后续世代中被继承。由于转化过程是相对低效率的， 所以需要制备大量转化子，以便从不想要的大豆非种系转化子中鉴定并选择出优选的大豆 种系转化子。从转化过程获得的转化子许多是嵌合的或者是大豆非种系转化子。平均而言， 所有分离的转化子中大约40至70%是大豆非种系转化子。这些大豆非种系转化子是不想 要的，予以剔除。但该剔除过程只有当转化子在整个转化过程中被维持、并且达到成熟之后 方可进行。维持不想要的转化子，例如非种系大豆转化子，导致资源的低效利用。在转基因 植物的生产中耗费大量成本。这样的成本不仅仅在金钱方面的顾虑，还包括科研人员的时 间、器材、和实验室空间的耗费。
[0009] 开发并改进能够用于在大豆转化的起始阶段筛选并检测大豆种系转化子的方法 是非常令人期望的，因为该方法能提高转化过程的效率。
[0010] 前述的相关技术的实例以及与之相关的限定仅意在说明，并无排他性。本领域技 术人员在阅读了本说明书后会容易想到相关技术的其他限定。
[0011] 公开
[0012] 在一个优选的实施方案中，本公开涉及一种用于鉴定大豆种系转化子的方法，包 括下述步骤：用转基因转化大豆植物组织；从包含该转基因的经转化的大豆植物组织再生 芽（shoot);从经转化的包含该转基因的大豆植物组织分离该再生芽；使分离的再生芽与 膜接触，其中含有经转化的包含该转基因的大豆植物组织的植物材料从该分离的再生芽被 转移到并固定于该膜；测定该被转移的植物材料以确定所述转基因在该被转移的植物材料 内的位置；确定所述分离的再生芽内的转基因位置，其中所述转基因位置选自L2/L3组织 层和Ll组织层；并鉴定显示L2/L3组织层转基因位置的分离再生芽作为大豆种系转化子。
[0013] 在该实施方案的一个进一步的方面，提供了一种从鉴定出的大豆种系转化子再生 成熟转基因大豆植物的方法，包括：选择包含（comprising)大豆种系转化子的分离的再生 芽；并将该包含大豆种系转化子的分离的再生芽培养成为成熟的转基因大豆植物。
[0014] 在一个进一步的方面，所述的转化采用选自下组的转化方法：土壤杆菌转化、生物 射弹（biolistics)、磷酸|丐转化、聚凝胺（polybrene)转化、原生质体融合转化、电穿孔转 化、超声转化、脂质体转化、显微注射转化、裸DNA转化、质粒载体转化、病毒载体转化、碳化 娃介导转化、气溶胶聚束（aerosol beaming)转化、或PEG转化。
[0015] 在另一个方面，大豆植物组织选自下组：分生性（meristematic)大豆植物组织、 皮性（dermal)大豆植物组织、基本（ground)大豆植物组织、和维管大豆植物组织。
[0016] 在另一个方面，所述分生性大豆植物组织包括顶端分生组织、初生分生组织、或侧 生分生组织。
[0017] 在另一个方面，所述皮性大豆植物组织包括表皮。
[0018] 在另一个方面，所述皮性大豆植物组织包括周皮。
[0019] 在另一个方面，所述维管大豆植物组织包括木质部或韧皮部。
[0020] 在另一个方面，所述转基因包含在至少一个基因表达盒中。
[0021] 在另一个方面，所述基因表达盒包含可选择标志物基因。
[0022] 在另一个方面，所述基因表达盒包含性状基因。
[0023] 在另一个方面，所述基因表达盒包含RNAi基因。
[0024] 在另一个方面，所述分离包括对所述芽进行横向水平切割。
[0025] 在另一个方面，所述膜包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚四氟乙烯膜、或聚偏二氟乙 稀膜。
[0026] 在另一个方面，所述测定包括蛋白质检测测定。
[0027] 在另一个方面，所述蛋白质检测测定包括特异性结合从所述转基因表达的蛋白质 的抗体。
[0028] 在另一个方面，所述确定包括识别固定在所述膜上的被转移的植物材料内的点样 式（dot pattern)〇
[0029] 在另一个方面，所述确定包括识别固定在所述膜上的被转移的植物材料内的环样 式（ring pattern)〇
[0030] 除了上文所述的示例性方面和实施方案之外，通过研究下面的详细说明容易想到 其他方面和实施方案。
[0031] 附图简要说明
[0032] 图1描绘了 pDAB9381的质粒图。
[0033] 图2,图面a，展示了从大豆茎切片组织印渍（tissue print)观察到的环样式的 放大的化学发光图像。图2,图面b，从大豆茎切片组织印渍观察到的点样式的放大的化学 发光图像。图2,图面c，用于鉴定大豆茎切片组织印渍（黑点）之位置的经处理的硝酸纤 维素膜的落射白光照明图像。图2,图面d，经处理的硝酸纤维素膜的化学发光图像。抗体 对PhiYFP的结合导致产生大豆茎切片组织印渍的化学发光信号，该信号被归类为"环"或 者"点"图像样式。右下角格外明亮的化学发光信号为点样在膜上作为阳性对照的5ng纯 化的PhiYFP蛋白。
[0034] 图3展示了大豆茎切片的共聚焦荧光显微镜图像，这些切片用特异性检测PhiYFP 蛋白的激发/发射参数加以照明。这些图像显示了用于对大豆芽分类的三个类别：图面a， 无荧光；图面b，仅表皮细胞层的荧光；和图面c，髓和皮层的荧光。
[0035] 图4是正在发育的大豆分生组织的示意图。
[0036] 实施发明的模式
[0037] I.概览
[0038] 本发明公开了一种在植物转化过程的起始阶段筛选并检测大豆种系转化子的方 法。本公开的方法是为了快速鉴定并表征大豆种系转化子而设计的。简而言之，通过下述 方式完成对包含转基因的经转化大豆植物芽组织的分析：使芽组织与膜接触，并测定该膜 以确定所述转基因在所述植物材料内的位置。在大豆芽的核心（L2和L3)层表达转基因者 被鉴定为大豆种系转化子。图4显示了发育中的大豆分生组织的示意图。对于鉴定出的大 豆种系转化子进行选择并培养成为成熟的大豆植物。其他的大豆非种系转化子在早期从转 化过程剔除。这样，可以分析并筛选大豆种系转化子，以鉴定并选择具有插入到种系组织内 的供体DNA多核苷酸的特定转化子。
[0039] 本文公开的方法相对于先前开发的用于鉴定和选择大豆种系转化子的其他已知 方法而言是显著的改进。参见，美国专利号5, 503, 998、美国专利号5, 830, 728和美国专利 号5, 989, 915。这些先前的方法可以应用于利用对实际的茎的组织化学测定而进行颗粒轰 击转化和选择。开发可以用来筛选利用任何已知的转化规程产生的种系转化子，且不需要 对经转化的大豆组织进行化学染色的方法是非常令人期望的，因为该方法能提高转化过程 的效率。本申请公开了这样的方法。
[0040] II 术语
[0041] 除非有其他定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普 通技术人员所普遍理解的相同的意义。在冲突的情况下，以包括定义在内的本申请为准。除 非上下文要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
[0042] 为了进一步明确本公开，提供下述术语、缩写和定义。
[0043] 如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有""含有"，或它们的任何其它变型，都是非 排他性的或者说开放式的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、过程、步骤、方法、制品 或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、步骤、方 法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，"或"是指包含性的"或"，而不 是指排他性的"或"。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B :A为真（或存在）且B为 假（或不存在），A是为真（或不存在）且B是为真（或存在），以及A和B都为真（或存 在）。
[0044] 此外，本公开的实施方案的元素或组分之前的不定冠词"一"对实例的数目，即该 元素或组分的出现次数没有限制作用。因此"一"应该理解为包括至少一，且元素或组分的 单数单词形式也包括复数，除非数目显然应是单数。
[0045] 如本文中使用的术语"发明"或"本发明"是非限制性的术语，并不意图指代具体 发明的任何单一实施方案，而涵盖申请中公开的所有可能的实施方案。
[0046] 植物：如本文所使用的，术语"植物"包括整个植物及植物的任何后代、细胞、组织、 或部分。术语"植物部分"包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子（包括成熟种子 和未成熟种子）；植物插条；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官（如花粉、胚、花、果实、 芽（shoot)、叶、根、茎、和外植体）。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织、 或者任何其他被组织成一定结构或功能单元的植物细胞群。植物细胞或组织培养物可能能 够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并且可能能够再 生出与该植物具有基本上相同的基因型的植物。与之相反，一些植物细胞不能够再生产生 植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组 织、花粉、叶、花药、根、根尖、须、花、果仁、穗、穗轴、壳、或莖。
[0047] 植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部 分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和根砧木。植物的可收获部分可以是 植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。
[0048] 植物细胞是植物的结构和生理的单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是 分离的单细胞或细胞聚集体的形式（例如，松散型（friable)愈伤组织和培养细胞），并且 可以是更高级有组织单元的一部分（例如，植物组织、植物器官、和植物）。因此，植物细胞 可以是原生质体、配子产生细胞、或可以再生成完整植物的细胞或细胞集合。因此，种子，因 其包括多个植物细胞并能够再生为完整植物，在本文的实施方案中被认为是一种"植物细 胞"。
[0049] 分离的："分离的"生物组分（例如，核酸或多肽）已经与该组分天然存在的生物 细胞中的其它生物组分（即，其它染色体或染色体外DNA和RNA，和蛋白）实质上分离、与 之分别产生、或从之纯化出来，在分离、产生和纯化的同时实现了该组分的化学或功能变化 (例如核酸可以通过断裂连接该核酸与染色体中其余DNA的化学键而从染色体分离）。已 经"分离的"核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包括 通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子、蛋白和肽。
[0050] 核酸：术语"多核苷酸"、"核酸"和"核酸分子"在本文中可以互换使用，并包括单 个核酸、多个核酸、核酸片段、变体或其衍生物、和核酸构建体（例如信使RNA (mRNA)和质粒 DNA (pDNA))。多核苷酸或核酸可以含有全长cDNA序列、或其片段的核苷酸序列，包括非翻 译的5'和/或3'序列和编码序列。多核苷酸或核酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱 氧核糖核苷酸构成，其可以包括未修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或修饰的核糖核苷 酸或脱氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以包括单链、双链DNA ;单链区和双链区混 合物DNA ;单链和双链RNA ;单链区和双链区混合物RNA。包含DNA和RNA的杂交分子可以 是单、双链、或单链区和双链区的混合物。前述术语还包括化学、酶学和代谢修饰形式的多 核苷酸或核酸。
[0051] 应当理解，具体的DNA还指其互补物，其序列根据脱氧核糖核苷酸碱基配对的规 则确定。
[0052] 如本文所使用的，术语"基因"是指编码功能产物（RNA或多肽/蛋白）的核酸。基 因可以包含位于编码功能产物的序列之前（5'非编码序列）和/或之后（3'非编码序列） 的调节序列。
[0053] 如本文所使用的，术语"编码序列"是指编码特定氨基酸序列的核酸序列。"调节 序列"是指位于编码序列上游（例如，5'非编码序列）、内部或下游（例如，3'非编码序列） 的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列包括，例 如但不限于：启动子；翻译前导序列；内含子；多腺苷酸化识别序列；RNA加工位点；效应物 结合位点；和茎环结构。
[0054] 杂交：包含全部或部分核苷酸序列的核酸可以用作探针，与克隆的基因组DNA片 段或cDNA片段（例如，来自所选生物的基因组或cDNA文库）群体中存在的、与探针序列具 有显著量的序列同一性的核苷酸序列选择性"杂交"。杂交探针可以是基因组DNA片段、质 粒DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR扩增的DNA片段、寡核苷酸、或其他多聚核苷酸，并 且探针可以用可检测的基团（例如32P)或任何其他可检测的标记标记。因此，例如但不限 于，用于杂交的探针可以通过标记可特异性杂交本文中的核酸（例如与SEQ ID N0:1具有 至少大约90%同一性的核酸）的人造寡核苷酸加以制备。用于制备杂交探针和用于构建 cDNA和基因组文库的方法是本领域已知的。Sambrook等人.（1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY。关于核酸杂交的详尽指导可以参见Sambrook等人（1989)，同上；和 Ausubel 等人（1997) Short Protocols in Molecular BiologyjThird Edition, Wiley, NY, New York,pp.2-40〇
[0055] 如本文所使用的，术语"多肽"包括单个多肽、多个多肽、和其片段。该术语是指由 通过酰胺键（也称作肽键）线性连接的单体（氨基酸）构成的分子。术语"多肽"是指两个 或多个氨基酸构成的任何链，且不指示产物的具体长度和大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、 蛋白质、氨基酸链、和任何其它用于指示有两个或多个氨基酸的链的术语均包含在"多肽" 的定义之内，并且前述术语在本文中可以和"多肽"互换使用。多肽可以是从天然生物源分 离的或者通过重组技术产生的，但是具体的多肽不一定是从特定的核酸翻译产生的。多肽 可以用任何合适的方式产生，包括例如但不限于，通过化学合成。
[0056] 内源的和异源的：如本文所使用的，术语"天然的"是指在自然界中发现的、并与其 自身的调节序列（如果存在的话）在一起的多核苷酸、基因或多肽形式。术语"内源的"是 指处于生物或生物基因组中的天然位置处的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。
[0057] 相反，术语"异源的"是指在参考（宿主）生物的位置处通常不会发现的多核苷酸、 基因或多肽。例如，异源核酸可以是通常在参考生物的不同基因组位置处被发现的核酸。作 为进一步的实例，异源核酸可以是通常不会在参考生物中被发现的核酸。含有异源多核苷 酸、基因或多肽的宿主生物可以通过将异源多核苷酸、基因或多肽导入到宿主生物内而产 生。在特定的实例中，异源多核苷酸包括以不同于相应的天然多核苷酸的形式被重新导入 到来源生物内的天然编码序列、或其部分。在特定的实例中，异源基因包括以不同于相应的 天然基因的形式被重新导入到来源生物内的天然编码序列或其部分。例如，异源基因可以 包括天然编码序列，该天然编码序列是含有非天然调节区的嵌合基因的一部分，该嵌合基 因被重新导入到天然宿主内。在特定的实例中，异源多肽是以不同于相应的天然多肽的形 式被重新导入到来源生物内的天然多肽。
[0058] 异源基因或多肽可以是这样的基因或多肽，其包含功能性多肽或编码功能性多肽 的核酸序列，该功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列与其它基因或多肽融合从而产生 嵌合或融合的多肽或编码它的基因。基因和蛋白的特定实施方案包括具体例举的全长序列 和部分、区段、片段（包括与全长分子相比具有内部和/或末端缺失的连续片段）、变体、突 变体、嵌合体、以及这些序列的融合。
[0059] 修饰：如本文所使用的，术语"修饰"可以指特定参考多核苷酸内的改变，其导致 由该参考多核苷酸编码的多肽的活性降低、基本上消失、或消失。修饰还指参考多肽中的 改变，其导致参考多肽的活性减低、基本上消失、或消失。或者，术语"修饰"可以指参考多 核苷酸中的改变，其导致该参考多核苷酸编码的多肽的活性增加或提高，以及参考多肽中 的改变，其导致参考多肽的活性增加或提高。诸如前述的改变可以通过任何本领域众所周 知的方法实现，这样的方法有若干种，包括，例如但不限于：缺失参考分子的一部分；突变 参考分子（例如通过自发诱变；通过随机诱变；通过增变基因导致的诱变；和通过转座子诱 变）；取代参考分子的一部分；在参考分子内插入元件；下调参考分子的表达；改变参考分 子的细胞定位；改变参考分子的状态（例如通过参考多核苷酸的甲基化，和通过参考多肽 的磷酸化或泛素化）；除去参考分子的辅助因子；导入靶向参考分子的反义RNA/DNA ;导入 靶向参考分子的干扰RNA/DNA ;参考分子的化学修饰；参考分子的共价修饰；用UV辐射或 X射线辐照参考分子；改变参考分子的同源重组；改变参考分子的有丝分裂重组；代替参考 分子的启动子；和/或前述的任意组合。
[0060] 可以通过比较参考多核苷酸或多肽的序列与同源（例如同源酵母或细菌）多核苷 酸或多肽的序列，并使高度同源区（保守区）或共有序列中的修饰数目最大化，来找到确定 在具体实例中哪些核苷酸或氨基酸残基可以被修饰的指引。
[0061] 启动子：术语"启动子"指一种能够控制核酸编码序列或功能RNA的表达的DNA序 列。在实例中，受控制的编码序列位于启动子序列的3'。可以从天然基因中整体获得启动 子，启动子可以包括来自天然出现的不同启动子的不同元件，或者启动子甚至可以包括人 造的DNA片段。本领域的技术人员理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类 型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境或生理条件表达。所有上述启动子的实 例都是已知的，并且在本领域中用于控制异源核酸的表达。指导基因在大多数细胞类型中 在大部分时间里表达的启动子通常称为"组成型启动子"。此外，虽然本领域技术人员已经 尝试界定调节序列的确切边界（在许多情况下未成功），但是已经认识到，长度不同的DNA 片段可能具有相同的启动子活性。特定核酸的启动子活性可以使用本领域熟知的技术进行 测定。
[0062] 可操作连接：术语"可操作连接"是指单一核酸上的多个核酸序列的关联，其中