miR-204和miR-211及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及至少一种能够提高对象的细胞中一种或多种miRNA水平的试剂、相关 药物组合物、核酸、载体和宿主细胞，所述miRNA包含序列UUCCCUU，所述试剂用于治疗和/ 或预防视网膜营养不良，特别是以感光细胞退化为特征的那些。
【背景技术】
[0002] 微小RNA(miRNA)是基因表达的转录后调控因子，其在生理和病理状态中的基础 生物过程的控制方面起关键作用。越来越多的证据表明，miRNA可通过靶向功能上相关基因 的基因网络来控制特定的功能通路。在人中，miRNA本身或其靶基因中突变导致的miRNA表 达失调已与多种病理病症（如糖尿病、神经退行性疾病、心力衰竭和遗传性耳聋（1，2)等） 相关。最近，miRNA也开始作为多种疾病的治疗性介入的新靶标。miRNA的治疗性功能已描 述于多种癌症模型（3,4)、心脏病（5,6)、肌肉萎缩症（7)和肝疾病（8,9)中。1^1^-122的 应用已进入临床，其中在以治疗丙型肝炎感染为目的方面处于I期试验（10)。因此，miRNA 的治疗性应用代表现代医学中理想的研究领域，但其广泛应用需要正确了解由miRNA控制 的基因表达变化。
[0003] 视网膜是一种层状结构，由六个神经元和一个神经胶质细胞类型组成，其构成 为三个细胞层：神经节细胞层（包含视网膜神经节（RGC)和移动性无长突细胞）、内核层 (INL)(含有双极、水平和无长突中间神经原和穆勒胶质细胞（MiIller glial cells))以及 外核层（ONL)(其中有视杆细胞和视锥细胞）。视网膜紧邻视网膜色素上皮细胞（RPE)(-种 滋养视网膜视细胞的色素细胞层），并牢固连接下方的脉络膜和上方的视网膜视细胞（图 20)。
[0004] 遗传性视网膜营养不良（IRD)是西方遗传学眼盲的最常见病因之一。该类疾病的 潜在主要病症是感光细胞（即将光信息转化为化学和电信号并随后通过视觉回路传输至 脑的细胞）的退化。在人视网膜中存在两种类型的感光细胞：视杆细胞和视锥细胞。视杆 细胞代表人视网膜中约95%的感光细胞并负责感知对比度、亮度和移动，而高分辨率、空间 分辨率和色觉由视锥细胞感知。
[0005] IRD可细分为不同的疾病组，即色素性视网膜炎（RP)、莱伯先天性黑朦（LCA)、视 锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。
[0006] RP是遗传学视网膜营养不良的最常见形式，近似频率为约4000名个体中存在一 名患者（11)。在其临床发作阶段，RP的特征是夜盲和进行性感光细胞退化，伴随骨针样色 素沉积和降低或缺失的视网膜电图（ERGhRP可以是分离的或综合征的，即与眼外表现（如 在亚瑟综合征（Usher syndrome)和巴尔得-别德尔综合征（Bardet-Biedle syndrome)中） 相关。从遗传观点来看，RP是高度异质性的，具有常染色体显性、常染色体隐性和X连锁的 遗传模式。然而，很大百分比的RP患者是明显分散的。迄今为止，已发现约50个致病基因 /基因座负责非综合征形式的RP并发现超过25个致病基因/基因座负责综合征RP (RETnet 网站出1^://￥￥￥.3011.111；11.1；111(：』(111/1^价1；/)〇
[0007] LCA的发病率为每100000个体中约2-3人，且特征为生命的第一个月/年开始的 严重视觉缺陷（12)。LCA具有视网膜、眼睛和眼外特征，且偶尔是系统性相关联的。LCA在大 部分患者中以常染色体隐性性状继承，而仅在少数病例中报道了常染色体显性继承。LCA具 有遗传异质性，且迄今为止已在15种不同基因中鉴定到突变：GUCY2D(基因座名称LCAl)、 RPE65 (LCA2)、SPATA7 (LCA3)、AIPLl (LCA4)、LCA5 (LCA5)、RPGRIP1 (LCA6)、CRX (LCA7)、 CRBl (LCA8)、CEP290 (LCAlO)、MPDHl (LCAll)、RD3 (LCAl2)、NMNATl (LCA9)、LRAT (LCA14)、 TULP1(LCA15)和RDH12(LCA13)。LCA的诊断由临床发现结果建立。对于目前已知与LCA相 关的15种基因，分子遗传学测试是临床上可行的。总的来说，预测这些基因中的突变导致 所有LCA病例中的约40% -50%，这依赖于征询工作。
[0008] 视锥细胞-视杆细胞营养不良（CRD)发病率为1/40000个体，且特征为眼底检查 时可见的视网膜色素沉积，其主要位于黄斑区。与典型的RP不同（其特征为先发生视杆 感光细胞损失，随后发生视锥感光细胞损失），CRD中事件顺序相反。CRD的特征为，主要涉 及视锥细胞，或有时伴随视锥细胞和视杆细胞的共同损失，这解释了 CRD的主要症状：视力 减弱、色觉缺陷、厌光（photo-aversion)和中心视野灵敏度降低，随后是周边视野的进行 性损失和夜盲（13)。已有至少20种不同基因中的突变与CRD相关（RETnet网址：http:// www. sph. uth. tmc. edu/RetNet/) 〇
[0009] 视锥细胞营养不良（CD)是其中视锥感光细胞显示选择性功能障碍且该选择性功 能障碍不延伸至视杆细胞的病症。其特征为视觉缺陷、色觉异常、视野损失和不同程度的眼 球震颤和畏光。在CD中，视锥功能在视网膜电图（ERG)和心理物理测试中缺失或严重受损 (14)。与其他形式的遗传性视网膜营养不良类似，CD是异质性病症，可由至少10种不同基 因中的突变导致（RETnet 网址：http://www. sph. uth. tmc. edu/RetNet/)。
[0010] 同样如上文所述，IRD归因于感光细胞的退化和随后的死亡，所述感光细胞在RP 和LCA中主要是视杆细胞，而在CRD和CD中主要是视锥细胞。感兴趣的是，在RP和大多数 形式的LCA中，视杆细胞退化之后是视锥细胞的继发性退化。大多数负责IRD的基因主要 表达在感光细胞（视杆细胞或视锥细胞）中。一些IRD基因普遍表达在视网膜色素上皮细 胞中。然而，同样在后一种情况中，这些基因失调的主要后果是感光细胞功能的损伤，其随 后转化为感光细胞退化和死亡。对于大多数形式的上述疾病，目前没有有效的治疗方法。
[0011] 作者目前正在研究miRNA用作遗传性视网膜营养不良中的治疗工具的可能性。作 者最近研究了哺乳动物眼部发育的主要阶段期间miRNA的表达模式，并生成了迄今为止最 具综合性的哺乳动物眼中miRNA的表达图谱（15,16)。
[0012] 结果是，作者鉴定到了一个miRNA亚组，其显示在哺乳动物眼中具有显著的表达 水平，其中有miR-204和miR-211。作者开始对后者miRNA进行详细的功能表征，大部分使 用体内模型。具体而言，通过在青鏘鱼（Oryziaslatipes(ol))模式生物中使用功能获得 和功能丧失方法，作者已于先前证明，miR-204活性的变化显著影响了眼分化和功能的多个 方面。具体而言，吗啉代介导的miR-204表达消融导致特征为小眼畸形和改变的视网膜的 背-腹（D-V)模式的眼表型，其导致视缺损（17)。
[0013] 有趣的是，miR-204和miR-211是哺乳动物中密切相关的旁系同源物，其共有相同 的种子区序列和相同的预测靶标组（TargetScan) (18)。其在小鼠中仅相差一个核苷酸且在 人中仅相差两个核苷酸。
[0014] 最近，已表明miR-204和miR-211对作为阻隔物的视网膜色素上皮细胞（RPE)的 完整性和防止其异常增殖具有保护性作用（23)。
[0015] 基于此，已提出向RPE递送这两种miRNA可对RPE分化和增殖异常导致的眼部疾 病（包括玻璃体视网膜营养不良、黄斑变性和糖尿病视网膜营养不良）产生有益作用。
[0016] 申请 W02010027838 涉及通过给予 miR-204、miR-211 或 miR-204 和 miR-211 的混 合物来预防或治疗有害视网膜上皮细胞增殖、视网膜上皮细胞分化丧失、年龄相关黄斑变 性和/或增殖性玻璃体视网膜营养不良的方法。
[0017] 文献W02009137807涉及通过给予miR-211的抑制剂来诊断和/或治疗眼的血管 疾病（特别是眼或视网膜/脉络膜新生血管疾病）的方法和组合物。这些方法涉及检测患 者样品中一种或多种miRNA的水平，并使用测试结果诊断和/或预测针对该患者的最佳治 疗方案。据称使用miR-211导致血管生成增加。
[0018] 仍需要对遗传性视网膜营养不良的主要病症感光细胞退化和死亡具有保护性作 用的疗法。在这类疾病中，异常RPE分化和增殖不起关键的致病性作用。
【发明内容】
[0019] 本发明涉及miRNA miR-204和/或miR-211用于保护视网膜不发生神经元变性的 应用。本发明的作者发现，视网膜内给予miR-204和/或miR-211(特别是在感光细胞内） 对于感光细胞退化具有有益作用，且特别是在IRD中，包括视网膜色素变性（单独的和综合 征形式）、莱伯先天性黑朦、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。应注意，这 表明通过体内给予感光细胞单种miRNA获得的疗效。
[0020] miRNA与一种或多种mRNA的部分或片段互补。此外，miRNA无需以绝对序列互补 性来结合mRNA，这使得其能够调控大范围的靶转录本。miRNA通常以匹配的核苷酸之间具 有缺口的形式结合靶序列。本文中，术语"绝对序列互补（性）"旨在描述需要各核苷酸对 沿两条序列（如miRNA和靶基因或转录本）的长度结合且不存在缺口。术语"互补（性）" 旨在描述两条序列中至少约50%的核苷酸从一条序列反式结合至另一条序列。
[0021] miRNA通常与mRNA转录本的3' UTR互补，然而，本发明的miRNA可结合靶mRNA的 任何区域。或者或此外，miRNA靶向甲基化基因组位点，其对应于编码靶向的mRNA的基因。 基因组DNA的甲基化状态部分决定了 DNA对转录因子的可及性。同样地，DNA甲基化和去 甲基化分别调控基因沉默和表达。
[0022] 本发明的miRNA包括表1中的序列（SEQ ID NO. 1-5)及其同源物和类似物、miRNA 前体分子和编码所述miRNA的DNA分子。
[0023] 表 1
[0024]
[0025] 存在两种形式的成熟小鼠 miR-204 序列：5' -UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU-3'（S EQ ID NO:l ;miRBase 登录号 MMAT0000237)和 5'-UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCUG-3'（SEQ ID NO:2;GenBank 登录号 AJ560745)。基于对紧密连续成对物（closely run doublet) 的观察，两种miRNA都存在于小鼠中。人成熟miR-204的序列为5' -UUCCCUUUGUCAUCC UAUGCCU-3'（SEQ ID NO: 3 ;miRBase 登录号 MMAT0000265)。成熟小鼠 miR-211 的序列 为 5' -UUCCCUUUGUCAUCCUUUGCCU-S' ；SEQ ID N0:4(miRBase 登录号 MMAT0000668)。人 成熟!1^1^-211的序列为5'-而0：〇]1]1^1^41]〇：1]1^00：1]-3'6￡〇10购:5 ;1^1^136登录号 MIMAT0000268)〇
[0026] 优选地，同源物与SEQ ID NO 1-5的序列的相同性可以是至少90%，更优选至少 95 %相同。
[0027] 因此，本发明的一个目的是提供能够提高对象的一种或多种细胞中一种或多种 miRNA水平的至少一种试剂，所述miRNA包含序列UUCCCUU，所述试剂用于治疗和/或预防 视网膜营养不良。
[0028] 序列UUCCCUU是种子序列。种子区与靶mRNA形成紧密的双链体。大多数miRNA 与靶mRNA的3'非翻译区（UTR)具有不完美碱基配对，且miRNA的5'近端"种子"区提供 了大多数的配对特异性。不受任何理论的约束，认为前九个miRNA核苷酸（包括种子序列） 具有较高的特异性，而该区域的3'侧的miRNA核糖核苷酸序列允许较低的序列特异性并因 此耐受较高程度的错配碱基配对，其中2-7位是最重要的。
[0029] 在本发明中，该试剂优选选自miRNA、miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物或 miRNA模拟物的混合物，编码所述miRNA、所述miRNA前体、所述成熟miRNA、所述miRNA模拟 物或miRNA模拟物的混合物的RNA或DNA分子，或其任意组合。
[0030] 优选地，所述试剂包含序列UUCCCUU或编码包含序列UUCCCUU的核苷酸序列。
[0031] 优选地，包含序列UUCCCUU的至少一种miRNA是miR-204的成熟序列或miR-211 的成熟序列。
[0032] 应注意，成熟miRNA的长度通常是约19-24个核苷酸（及其间任何范围），特别是 21、22或23个核苷酸。然而，可以长度为约70至约100个核苷酸的前体形式提供miRNA (前 体-miRNA)。应注意，可通过加工长度超过约100个核苷酸的初级转录本（初级-miRNA)来 生成前体。
[0033] 这样的miRNA通常是单链分子，而miRNA前体通常是至少部分自我互补的分子，其 能够形成双链部分，例如茎和环结构。编码miRNA、前体-miRNA和初级-miRNA的DNA分子 也包括在本发明中。这些核酸可选自RNA、DNA或核酸类似物分子，例如糖或主链修饰的核 糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。然而，应注意，其他核酸类似物（如肽核酸（PNA)或锁核酸 (LNA))也是合适的。
[0034] 本发明的核酸分子可获自化学合成方法或重组方法，例如通过从合成的DNA模板 中或分离自重组生物体的DNA质粒中酶促转录。通常，噬菌体RNA聚合酶用于转录，例如 T7、T3或SP6 RNA聚合酶。
[0035] 本发明还涉及一种重组表达载体，其包含与表达控制序列可操作连接的重组核 酸，其中，表达（即转录）和任选的进一步加工导致形成上文所述的miRNA分子或miRNA前 体（初级-或前体-miRNA)分子。该载体可以是适用于真核细胞（更具体是哺乳动物细 胞）中核酸表达的表达载体。所述载体中含有的重组核酸可以是导致上述miRNA分子、其 前体或初级转录本转录的序列，其可进一步加工以得到miRNA分子。
[0036] 所述试剂优选包含miR-204的成熟序列或miR-211的成熟序列。
[0037] 在优选的实施方式中，所述试剂在递送载剂中提供，任选地，所述递送载剂选自病 毒载体、微球、脂质体、胶体金颗粒、脂多糖、多肽、多糖或PEG化病毒载剂。
[0038] 在优选的实施方式中，该视网膜营养不良的特征是感光细胞退化。优选地，该视网 膜营养不良是遗传性视网膜营养不良。更优选地，遗传性视网膜退化选自：色素性视网膜炎 (RP)、莱伯先天性黑朦（LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。
[0039] 本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防视网膜营养不良的药物组 合物，所述药物组合物包含至少一种试剂和药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂，所述至 少一种试剂能够提高一种或多种miRNA的水平，所述miRNA包含序列UUCCCUU，如上文所定 义。
[0040] 所述试剂优选选自：miRNA、miRNA前体、成熟miRNA、miRNA模拟物或miRNA模拟物 的混合物，编码所述miRNA、所述miRNA前体、所述成熟miRNA、所述miRNA模拟物或miRNA 模拟物的混合物的RNA或DNA分子，或其任意组合，所述试剂优选包含序列UUCCCUU或编码 包含序列UUCCCUU的核苷酸序列，所述试剂优选包含miR-204的成熟序列或miR-211的成 熟序列。
[0041] 本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防视网膜营养不良的核酸序 列，所述核酸序列编码上文定义的试剂。
[0042] 本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防视网膜营养不良的重组表 达载体，所述重组表达载体包含合适启动子控制下的上文所定义试剂的编码序列。
[0043] 优选地，该合适的启动子是视紫红质启动子序列。
[0044] 更优选地，上文所定义的重组表达载体还包含合适启动子控制下的负责视网膜营 养不良的一种或多种野生型编码序列。优选地，该合适的启动子是视紫红质启动子序列或 驱动RPE表达的启动子。
[0045] 优选地，负责视网膜营养不良的一种或多种野生型编码序列选自SEQ ID NO:23至 SEQ ID N0:414。
[0046] SEQ ID NO:23至SEQ ID N0:414的任意组合都适用于本发明。
[0047] 优选地，该野生型编码序列是AIPLl的编码序列。
[0048] 在优选的实施方式中，上文定义的重组表达载体是AAV衍生物。
[0049] 本发明的另一个目的是提供一种由上文所述重组病毒载体转化的宿主细胞。
[0050] 本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防视网膜营养不良的药物组 合物，其包含上文定义的核酸序列或上文定义的重组表达载体或上文定义的宿主细胞，和 药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。
[0051] 优选地，该药物组合物还包含合适启动子控制下的负责视网膜营养不良的一种或 多种野生型编码序列。
[0052] 优选地，所述负责视网膜营养不良的野生型编码序列插入其他分离或独立的重组 表达载体中。
[0053] 优选地，在上文定义的药物组合物中，负责视网膜营养不良的一种或多种野生型 编码序列选自 SEQ ID NO:23 至 SEQ ID NO:414。
[0054] 优选地，该野生型编码序列是AIPLl的编码序列。
[0055] 优选地，上文定义的药物组合物用于眼内给药。
[0056] 本发明的另一个目的是提供一种用于治疗和/或预防对象中视网膜营养不良的 方法，包括向所述对象给予上文定义的试剂或上文定义的药物组合物或上文定义的核酸或 上文定义的重组表达载体或上文定义的宿主细胞。
[0057] 优选地，该视网膜营养不良的特征是感光细胞退化。
[0058] 考虑本发明的治疗方法可与治疗视网膜营养不良的其他方法联用。其他治疗剂 可包括神经保护性分子，如：生长因子如睫状神经营养因子（CNTF)、神经胶质源性神经营 养因子（GDNF)、心肌营养素1、脑源性神经营养因子（BDNF)和基本成纤维细胞生长因子 (bFGF)或视杆细胞源性视锥活力因子（如RdCVF和RdCVF2)。
[0059] 在本发明中，负责视网膜营养不良（特别是以感光细胞退化为特征的视网膜营养 不良，特别是遗传性视网膜营养不良）的野生型编码序列选自以下基因：ABHD12、ACBD5、 ADAM9、ADAMTS18、AIPLl、ARL2BP、ARL6、BBIPl、BBS 1、BBS 10、BBS12、BBS2、BBS4、BBS5、 BBS7、BBS9、C21orf2、C2orf71、C8orf37、CACNA2D4、CDH23、CDH3、CDHRl、CEP290、CERKL、 CIB2、CLRN1、CNGA1、CNGB1、CNNM4、CRB1、DFNB31、DHDDS、EMC1、EYS、FAM161A、GPR125、GPR98、 GUCY2D、HARS、IDH3B、MPG2、IQCBl、KCNJ13、KCNV2、KIAA1549、LCA5、LRAT、MAK、MERTK、 MKKS、MKSl、MVK、MY07A、NEK2、NMNATI、OFDl、0TX2、PCDHl5、PDE6A、PDE6B、PDE6C、PDE6G、 PRCD、PROMl、RAB28、RAX2、RBP3、RD3、RDH12、RGR、RLBPl、RP2、RPE65、RPGR、RPGRIP1、SAG、 SDCCAG8、SPATA7、TR M3 2、TTC8、TTPA、TULPI、UNC119、USHIA、USHIC、USHIG、USH2A、ZNF513。 相对编码序列是由SEQ ID N0:23至SEQ ID N0:414组成的序列。
[0060] 遗传性视网膜营养不良（IRD)是西方遗传学眼盲的最常见病因之一。该类疾病的 潜在主要病症是感光细胞（即将光信息转化为化学和电信号并随后通过视觉回路传输至 脑的细胞）的退化。IRD可细分为不同的疾病组，即色素性视网膜炎（RP)、莱伯先天性黑朦 (LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良。本发明的试剂治疗和/或预防 一种或多种这类疾病。
[0061] 在本发明中，所考虑的能够提高一种或多种miRNA水平的试剂包括miRNA分子、单 链或双链RNA或DNA多核苷酸、肽核酸（PM)、蛋白质、小分子、离子、聚合物、化合物、抗体、 胞内抗体、诘抗剂或其任意组合。该试剂可增大miRNA表达水平、活力和/或功能。
[0062] 在一些方面中，能够提高一种或多种miRNA水平的试剂可以是RNA或DNA分子，其 可含有至少一种修饰的核苷酸类似物，即天然产生的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸被非天 然产生的核苷酸取代。修饰的核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5'端和/或3'端处。
[0063] 核苷酸类似物可选自糖或主链修饰的核糖核苷酸。但应注意，核碱基修饰的核糖 核苷酸（即含有非天然产生的核碱基代替天然产生的核碱基的核糖核苷酸，如5位处具有 修饰的尿苷和胞苷，如5-(2-氨基）丙基尿苷、5-溴尿苷；8位处具有修饰的腺苷和鸟苷，如 8-溴鸟苷；去氮核苷酸，如7-去氮-腺苷；O-和N-烷基化的核苷酸，如N6-甲基腺苷）也 是合适的。在糖修饰的核糖核苷酸中，2'-OH-基团被选自下组的基团取代：H、OR、R、卤素、 SH、SR、NH 2、NHR、NR 2或CN，其中R是C I-C 6烷基、烯基或炔基，且卤素是F、CI、Br或 I。在优选的主链修饰的核糖核苷酸中，与相邻核糖核苷酸连接的磷酸酯基团被修饰的基团 取代，例如硫代磷酸基团。应注意，上述修饰可联用。
[0064] 在本发明中，"miR模拟物或类似物"是小双链RNA寡核苷酸，其可经化学修饰并模 拟内源性miRNA，并能够通过上调miRNA活性来促进miRNA功能分析。该模拟或类似序列对 应于miRNA成熟序列。
[0065] 在本发明中，感光细胞退化是感光细胞的进行性恶化且最终死亡。
[0066] 感光细胞退化和死亡是遗传性感光细胞退化的主要病症，特别是遗传性视网膜营 养不良中的遗传性感光细胞退化。在感光细胞退化中，异常RPE分化和增殖不起关键的致 病性作用。
[0067] 本发明的试剂对于感光细胞退化具有治疗性活性，该作用不同于对于上皮细胞分 化或增殖的作用。
[0068] 在本发明中，miR-204/211表示miR-204和/或miR-211。大多数miRNA不完美地 与靶mRNA的3'非翻译区（UTR)碱基配对，且miRNA的5'近端"种子"区具有大部分的配对 特异性。不受任何理论的约束，认为前九个miRNA核苷酸（包括种子序列）具有较高的特异 性，而该区域的3'侧的miRNA核糖核苷酸序列允许较低的序列特异性并因此耐受较高程度 的错配碱基配对，其中2-7位是最重要的。可通过许多本领域已知的技术来生成miR-204、 miR-211的模拟物或类似物。核糖的2'羟基可被烷基化，例如甲基化，以提高分子的稳定 性。同样地，可通过使用氢取代2'位的羟基来修饰核糖，从而生成DNA主链。同样地，RNA 序列的任何尿嘧啶碱基都可被胸腺嘧啶取代。这些仅仅是本领域技术人员能够完成的可能 的修饰中的一些非限制性示例。
[0069] 在本发明中，可通过视网膜下注射AAV构建体将miR-204和/或miR-211递送至 视网膜。然而，重要的是指出成熟形式的miRNA也可以双链RNA寡核苷酸的形式（微小RNA 模拟物）递送至视网膜，其递送可通过与其他分子结构联用或使用运载体（如脂质体或纳 米颗粒）包封来得到增强（24)。此外，miR-204/211 AAV构建体或miR-204/211模拟物都 可以可注射悬浮剂、眼洗剂或眼用软膏的形式制备，其可使用非侵入性方法递送至视网膜。
[0070] 可通过已知方法进行本发明的寡核苷酸的给药，其中在以体外或体内方式将核酸 导入所需靶细胞中。
[0071] 本发明的一个方面包括包含在递送载剂内的核酸构建体。递送载剂是可将核苷酸 序列从至少一种介质运输至另一种介质的实体。递送载剂可通常用于核酸构建体内编码序 列的表达和/或细胞内递送构建体。在本发明的范围内，该递送载剂可以是选自下组的载 剂：基于RNA的载剂、基于DNA的载剂/载体、基于脂质的载剂、基于病毒的载剂和基于细胞 的载剂。这类递送载剂的示例包括：生物可降解聚合物微球、基于脂质的制剂如脂质体运载 体、在胶体金颗粒上包覆构建体、脂多糖、多肽、多糖、PEG化病毒载剂。
[0072] 在本发明的一个实施方式中，可包括病毒作为递送载剂，该病毒可选自：腺病毒、 反转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、疱瘆病毒、痘苗病毒、泡沫病毒、巨细胞病毒、塞姆利基森 林病毒、痘病毒、RNA病毒载体和DNA病毒载体。此类病毒载体为本领域熟知。
[0073] 通常使用的基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-右旋糖酐、转染、电穿孔和微注射以 及病毒方法（30-34)。用于将DNA导入细胞的另一种技术是使用阳离子脂质体（35)。市售可 得的阳离子液体制剂是例如Tfx 50 (普洛麦格公司（Promega))或Lipofectamin 2000(生 命技术公司（Life Technologies))。
[0074] 本发明的组合物可以是溶液剂的形式，例如可注射溶液剂、乳膏剂、油膏剂、片剂、 悬浮剂等。该组合物可以任何合适的方法给予，例如通过注射，特别是通过眼内注射、通过 口服、局部、经鼻、直肠施用等。该运载体可以是任何合适的药物运载体。优选地，可以使用 运载体，其能够提高RNA分子进入靶细胞的效率。这类运载体的合适示例是脂质体，特别是 阳离子脂质体。
[0075] 本发明的一个方面还包括含有一种或多种miRNA的药物组合物，其用于以适用于 体内给药的生物相容的形式给予对象。本发明的miRNA可在上述表达载体内提供，其在合 适的药物组合物中配制。
[0076] "适用于体内给药的生物相容的形式"指待给予的物质形式的治疗效果抵消任何 毒性作用。给予治疗活性量的本发明的组合物或"有效量"定义为在一定剂量和作用时间 下，有效于实现提高/降低蛋白质生成的所需结果的量。物质的治疗有效量可根据一些因 素而变化，所述因素包含，例如疾病状态/健康、接受者的年龄、性别和体重、特定多肽、编 码其的核酸或重组病毒引发所需应答的固有能力。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。 例如，可每天或采取其它合适的时间间隔给予数个分开的剂量，或者该剂量可按治疗情况 危急程度的指示按比例减少。用于给药的miRNA或miRNA调节剂的量可取决于给药途径、 给药时间，并根据个体对象应答变化。合适的给药途径是肌内注射、皮下注射、静脉内注射 或腹膜内注射、口服和鼻内给药。在IRD的情况下，优选将基于miRNA和/或miRNA调节剂 的组合物注射至对象的视网膜中。本发明的组合物还可通过植入物提供，其可用于使该组 合物随时间缓释。
[0077] 在感光细胞退化的情况下，例如在IRD中（具体而言是色素性视网膜炎（RP)、莱伯 先天性黑朦（LCA)、视锥细胞-视杆细胞营养不良和视锥细胞营养不良），可以有效体积将 本发明的基于miRNA和/或miRNA调节剂的组合物局部给予至眼，所述有效体积是约5微 升至约75微升，例如约7微升至约50微升，优选约10微升至约30微升。本发明的miRNA 在水性溶液中高度可溶。在眼中局部滴注体积大于75微升的miRNA可能会导致miRNA通 过溢出和排出从眼中损失。因此，优选通过以约5微升至约75微升的体积局部滴注至眼的 方式来给予高浓度的miRNA (例如InM至100 μ M，优选范围为10至1000 nM)。
[0078] 在一个方面中，胃肠外给药途径可以是眼内给药。本发明的基于miRNA的组合物 的眼内给药可通过注射或直接（如局部）给予至眼来实现，前提是给药途径允许miRNA进 入眼。除上述对眼给药的局部途径外，合适的眼内给药途径还包括玻璃体内、视网膜内、视 网膜下、眼筋膜囊下、眼球周边和眼球后、跨角膜和跨巩膜给药。这类眼内给药途径是本领 域公知常识（36-39)。
[0079] 本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并可用于转化或转染 任何合适的宿主。合适的载体包括设计为用于增殖或扩增或用于表达或用于以上两种目 的的那些，例如质粒和病毒。可使用标准DNA技术制备本发明的重组表达载体，参见例如 Sambrook等同上和Ausubel等同上。环形或线形表达载体构建体可制备为含有在原核或真 核宿主细胞中发挥功能的复制系统。
[0080] 复制系统可来源于例如CoIEl、2 μ质粒、λ、s V40、牛乳头瘤病毒等。
[0081] 优选地，该重组表达载体包含调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其是宿 主类型（如细菌、真菌、植物或动物）特异性的，可在适当时并fiM该载体是基于DNA还是 基于RNA以将该载体导入宿主。该重组表达载体可包含一个或多个标志物基因，其允许选 择转化或转染的宿主。标志物基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，其 在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型，等等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基 因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因 和青霉素抗性基因。该重组表达载体可包含天然或非天然启动子，其可操作地连接编码miR 204、miR 211和/或其模拟物（包括其功能性部分和功能性变体），或者连接与编码RNA 的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择（例如强、弱、可诱导、组织特异性 和发育特异性）是在本领域公知常识的范围内。类似地，将核苷