新型葡糖氧化酶变体的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本文提供的技术涉及具有改进性质的微生物葡糖氧化酶的新变体，更具体地涉及 具有葡糖氧化酶活性作为其主要酶活性的多肽；涉及编码所述葡糖氧化酶的核酸分子；含 有该核酸的载体和宿主细胞和用于生产该葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的组合 物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品饲料加工的方法、用于 测量临床样品和生物反应器中的游离葡萄糖的方法和开发微型生物燃料电池的方法。
【背景技术】
[0002] 葡糖氧化酶（β -D-葡萄糖：氧1-氧化还原酶；EC I. L 2. 3. 4)通过利用分子氧 作为电子受体催化β-D-葡萄糖氧化成葡糖酸，同时产生过氧化氢。微生物葡糖氧化酶近 来因其在化学、药物、食品、饮品、临床化学、生物技术和其它工业领域的多样化应用而备受 关注。近年来对葡糖氧化酶在生物传感器中的新应用的需求增强。葡糖氧化酶已从各种微 生物来源中分离。
[0003] 黑曲霉（Aspergillus niger)的葡糖氧化酶被用在例如食品加工和制药工业中， 并且用作医学诊断领域中免疫测定和生物传感器的组分。该酶还用于制造可为生物医学植 入物如生物传感器和胰岛素栗供能的微型生物燃料电池。这些装置的输出受到葡糖氧化酶 在阳极室内性能的限制。
[0004] 特别地，生物燃料电池领域中涉及三种酶学性质：⑴从电极向酶的电子转移速 率（固有酶活性）；⑵酶在生理条件（pH 7. 4和5mM葡萄糖）下的活性；和⑶酶的热稳 定性。
[0005] W089/126675记载了重组体系中从黑曲霉生产葡糖氧化酶，W02008/079227 Al涉 及赋予了改进的储存稳定性的从黑曲霉获得的葡糖氧化酶组合物。已公开了不同来源的葡 糖氧化酶，包括海藻类如角叉菜（Chondrus crispus) (US 7544795, US 6924366)、丝状真菌 如枝孢菌属（Cladosporium spp.) (W0 95/29996, WO 1998/020136, US 5834280)和黄蓝状 菌（Talaromyces flavus) (US 6054318)。W02012/017008 Al 公开了与野生型葡糖氧化酶 相比具有改变的酶促效率的黑曲霉葡糖氧化酶的变体。
[0006] 然而，获得具有针对众多应用的性质改进的葡糖氧化酶将是非常有利的。
【发明内容】
[0007] 根据本公开的改进的葡糖氧化酶可用于包括从食品和饮品中除去氧、生成过氧化 氢用于防腐、临床样品和生物反应器中游离葡萄糖的测定以及微型生物燃料电池的开发在 内的诸多应用。因此多种工业过程能够受益于根据本公开的葡糖氧化酶的改进变体的使 用。
[0008] 第一方面，本公开的实施方案提供具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包 括在对应于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶（SEQ ID N0:1)的氨基酸残基T30、I94、A162 位置处的变异，和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、V106、V293或E310位置处的至少 一个或多个其它变异，和其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO :1的氨基酸序列至少具 有至少80%的最小序列同一性百分比和/或同源性百分比。
[0009] 在另一方面，本公开的实施方案涉及选自由下述组成的组的核酸分子：
[0010] a)编码根据权利要求1至15任一项所述的多肽的核酸分子；
[0011] b)编码其中一个或多个氨基酸残基被保守性取代的根据权利要求1至15任一项 所述的多肽的核酸分子；
[0012] cHtSSEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:12SSEQIDN0:14 所示核酸分子的部分、变体、衍生物或片段的核酸分子；
[0013] d)或任意核酸分子a)-c)的互补体。
[0014] 在另一方面，本公开的实施方案涉及包括根据本公开的核酸分子的载体，并涉及 转化、转导或转染有所述载体的宿主细胞。
[0015] 还在另一方面，本公开的实施方案提供具有葡糖氧化酶活性的多肽的生产方法， 所述方法包括下列步骤：(a)在适合的培养基中在适合的条件下培养根据本公开的宿主细 胞以产生具有葡糖氧化酶活性的多肽；(b)得到所述产生的多肽，和任选地（C)加工所述多 肽。
[0016] 在另一方面，本公开的某些实施方案涉及包括根据本公开的多肽的组合物，特别 涉及食品组合物、药物组合物、诊断组合物或化妆品组合物。
[0017] 还在另一方面，某些实施方案提供样品中葡萄糖的测定方法，其中将样品与根据 本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽接触放置，并测定被葡糖氧化酶氧化的葡萄糖的量。
[0018] 另外，某些实施方案有关于样品中葡萄糖的测定装置和试剂盒，其包括根据本公 开的具有葡糖氧化酶活性的多肽和电子介质（electron mediator)。
[0019] 此外，某些实施方案涉及酶电极，其具有固定化在电极上的根据本公开的具有葡 糖氧化酶活性的多肽。
[0020] 另外，某些其它实施方案有关于测定葡萄糖的酶传感器，其包括根据本公开的酶 电极作为工作电极。
[0021] 在另一方面，实施方案涉及使用根据本公开的具有葡糖氧化酶活性的多肽用于食 品加工。
[0022] 特别地，在本公开的另一方面的实施方案中，有关于经修饰的葡糖氧化酶，其包括 在来自黑曲霉的天然存在的野生型葡糖氧化酶的氨基酸序列中在相对于来自黑曲霉的野 生型葡糖氧化酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)编号为556和537或37的位置处的至少三个 氨基酸残基的取代，和至少在对应于氨基酸残基556和537或者37和106位置处的取代， 和其中所述经修饰的葡糖氧化酶具有比野生型酶高的固有活性。
[0023] 在详细说明本公开之前，要理解的是，本公开不限于所记载的装置的特定构成要 件或所记载的方法的工序，因为这些装置和方法是可以更改的。还要理解的是，本文所用术 语仅出于描述特定实施方案的目的，并不意欲受其限制。必须注意的是，如说明书和所附 权利要求书中所使用的，除非上下文中有明确规定，否则单数形式的"一个/ 一种"("a"、 〃an〃）和〃所述/该〃 ("the")包括单个和/或多个参照对象。还要理解的是，如果参数范 围以数值限定给出，该范围视为包括这些极限值。
【附图说明】
[0024] 图1为示出根据本公开的GOx变体在ρΗ5· 5下的酶动力学的图。
[0025] 图2为示出根据本公开的GOx变体在ρΗ7· 4下的酶动力学的图。
【具体实施方式】
[0026] 本文公开的是葡糖氧化酶（β -d-葡萄糖：氧1-氧化还原酶EC I. 1. 2. 3. 4)的酶 变体，特别是包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的野生型黑曲霉葡糖氧化酶的变体，和编码所 述葡糖氧化酶变体的核酸分子，可用于包括食品加工和药品制造等工业应用，以及医学诊 断领域中免疫测定和生物传感器的组分。酶变体还可用于制造可为生物医学植入物如生物 传感器和胰岛素栗供能的微型生物燃料电池。
[0027] 特别地，根据本公开的葡糖氧化酶变体与野生型和亲本葡糖氧化酶相比显示改进 的催化效率和/或改进的稳定性能如热稳定性和/或PH稳定性。这些特性使其在工业和 诊断应用中特别有用。
[0028] -般而言，本公开有关于具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包括在对应 于来自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶（SEQ ID N0:1)的氨基酸残基T30和194位置处的变 异，和在对应于氨基酸残基M556、R537、R37、A162、V106、V293 或E310位置处的至少一个或 多个其它变异，和其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其变体、修饰 型、同源物、融合蛋白、功能等价物和片段至少具有至少80%的最小序列同一性百分比和/ 或同源性百分比。
[0029] 例如，根据本公开的同源多肽包括与SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ IDN0:11或SEQIDN0:13具有至少70%或优选至少80、85%、90%、95%、97%或99%的 序列同一性百分比且包括在对应于氨基酸残基T30和194位置处的变异和在对应于氨基酸 残基M556、R537、R37、A162、V106、V293或E310位置处的至少一个或多个其它变异的任意 活性葡糖氧化酶。
[0030] 本公开披露了一种葡糖氧化酶，其具有衍生自SEQ ID NO :1示出的氨基酸序列或 其变体、修饰型、同源物、融合蛋白、功能等价物和片段的氨基酸序列，在对应于氨基酸残基 T30和194位置处和在选自与M556、R537、R37、A162、V106、V293或E310结构上对应或氨 基酸序列同源的位置组中的一个或多个位置处的变异。
[0031] 如本文所使用的，〃细胞〃、〃细胞系〃和〃细胞培养物〃可互换使用，且所有这类 的命名都包括子代。因此，词语〃转化子〃或〃转化细胞〃包括原代受试细胞和由其产生 的培养物，而不考虑传代的次数。还要理解的是，所有子代由于有意或非有意突变而可能在 DNA含量上并不能完全一致。与原始转化细胞中筛选出的具有相同功能的突变子代包括在 内。
[0032] 如本文所使用的术语〃互补〃指两个核酸序列之间的关系。一个核酸序列如果 能够与第二个核酸形成二倍体，则其与第二个核酸序列互补，其中二倍体的各残基形成鸟 苷-胞苷（G-C)或腺苷-胸苷（A-T)碱基对或等同的碱基对。等同的碱基对可包括除鸟苷、 胞苷、腺苷或胸苷以外的核苷或核苷类似物。
[0033] 如本文所使用的短语〃对应于……的位置〃意指使用Vector NTI的AlignX 软件（获自 Invitrogen;参见Lu, G.和 Moriyama, E.N. (2004) Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform 5, 378-88)在默认参数下查询 氨基酸序列中与参考氨基酸序列中的氨基酸残基相比对的氨基酸残基的位置。因此，"对 应于SEQ ID NO:X示出的氨基酸序列的Y位置的位置处的氨基酸（AA)残基〃意指当使用 Vector NTI的AlignX在默认参数下将待查询的氨基酸序列与SEQ ID NO:X比对时，待查询 的氨基酸序列中与SEQ ID NO:X的氨基酸Y比对的氨基酸残基。应当注意的是，此术语也 包括SEQ ID NO:X的氨基酸Y本身。本公开的突变葡糖氧化酶显示增加的氧化酶活性，同 时基本上保留和/或增加酶稳定性，特别是热稳定性。
[0034] 如本文使用的"活性"或"催化活性"定量描述了在规定反应条件下给定底物的 转化。术语"残效"定义为特定条件设置下酶催化活性与不同条件设置下催化活性之比。 术语"比活"或"固有活性"定量描述了在规定反应条件下相对于酶量的催化活性。特别 地，氧化酶活性描述了葡糖氧化酶利用氧作为电子受体催化葡萄糖氧化生成葡糖酸内酯的 酶促活性。例如，氧化酶活性可用本公开实施例中记载的测定方法来测定（参见实施例7)。 如前所述，本文使用的葡糖氧化酶的"活性"可涉及其催化氧化反应D-葡萄糖+O2-葡糖 酸内酯+H2O2的能力的测量，并可表示为反应产物生成的速率。例如葡萄糖氧化酶活性可表 示为每单位时间或每单位葡糖氧化酶（如浓度或重量）所生成的产物的量（葡糖酸内酯和 / 或 H2O2)。
[0035] 根据本公开通过GO/变体改进的活性特别是固有活性（比活），而且还是一般活 性。如本文所使用的'Xat"意指高浓度底物（饱和条件）下的反应速度除以酶浓度（每酶 单位）。"C定义为酶达到最大速度时的底物浓度，但其与非饱和底物条件下、也就是低葡 萄糖浓度下的反应速度相关。〃KMt/K"；是特异性常数并总结了 2种性质。在有利的实施方 案中，根据本公开所有改进的GO/变体与野生型变体相比示出提高的更好的M以及 相应的Ukni)。
[0036] 根据本发明的术语〃酶〃意指完全或主要由蛋白质或多肽组成的、不同程度特异 性催化或促进一种或多种化学或生物化学反应的任何物质。术语"酶"还可指催