一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物保护领域，特别涉及一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法。
【背景技术】
[0002]木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV)最先被发现于巴基斯坦木尔坦地区棉花上一种植物病毒，是引起巴基斯坦棉花曲叶病大流行的主要病原病毒之一。该病毒属双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)；由烟粉虱以持久方式传播，但不能通过机械摩擦接种和种子带毒传播。该病毒基因组仅含A组分(DNA-A)，为单链环状，是一种单组分双生病毒。目前已报道的CLCuMuV各分离物普遍伴有β卫星分子(先前称之为DNA β)0 CLCuMuV主要分布于巴基斯坦、印度、菲律宾、老挝、越南及我国的广东、广西、海南、云南、福建、江苏等地，已报道的自然寄主包括棉花、朱槿、垂花悬铃花、黄秋葵、红麻等5种植物。
[0003]建立植物病毒人工接种方法，将其接种到相关寄主植物上，是研究病毒的致病性和为害性的前提和基础。关于CLCuMuV人工接种寄主植物的方法，目前已报道的方法有三种。Briddon等于2001年通过基因枪轰击接种方法将CLCuMuV接种棉花，并引起曲叶病(Briddon等，Virology, 2001, 285(2):234-243)。林林等于2011年通过烟粉虱传毒接种方法将CLCuMuV接种棉花、红麻、朱槿、西菲葵、黄蜀葵等5种植物，并引起它们发病(林林等，植物保护，2011，37(4):44-47)。汤亚飞和何自福等于2015年通过农杆菌介导的侵染性克隆注射接种方法将CLCuMuV接种棉花，并引起曲叶病(汤亚飞等，中国农业科学，2015)。截止目前，还没有关于通过农杆菌介导的侵染性克隆注射接种方法将CLCuMuV接种红麻的报道。
[0004]烟粉虱传毒接种方法，是利用烟粉虱在毒源植株上获毒(CLCuMuV)饲育一定时间，然后传毒接种到待健康植株上。该方法不足之处在于需要分离、纯化、饲养和保持烟粉虱种群，要求专业性强，且耗时，接种成功与否还受季节等环境因子影响明显，同时烟粉虱可能将毒源上包括CLCuMuV在内的各种病毒等微生物无区别地全部传播到接种植株上。基因枪轰击接种方法，是利用专业设备基因枪将包裹了带有CLCuMuV的高速微弹直接送入完整的植物组织细胞中。该方法不足在于需要购买价格昂贵的专业仪器基因枪，且需要专业人才操作，运行成本昂贵，难以适用于大量样本的操作。侵染性克隆注射接种方法，是将CLCuMuV的基因组克隆到植物表达载体上，并导入农杆菌中，通过人工注射接种到植物组织中，实现对植物的侵染。该方法操作简便、成本低、重复性好、结果准确等优点，但需要针对不同寄主植物研制不同的接种方法。
【发明内容】
[0005]本发明的首要目的在于提供一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，该方法操作具有简便、成本低、重复性好、结果准确等优点。
[0006]本发明的另一个目的在于提供上述木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法的应用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008]—种木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，包括如下步骤:
[0009](I)侵染性克隆的构建
[0010]将木尔坦棉花曲叶病毒(Cottonleaf curl Multan virus，CLCuMuV) 1.3 ?2.0个拷贝的正向重复全长基因组(DNA-A)和2个拷贝的正向重复β卫星分子φΝΑβ)分别构建到植物表达载体上，得到含有1.3?2.0个拷贝的正向重复全长基因组的侵染性克隆I和含有2个拷贝的正向重复β卫星分子的侵染性克隆II ;
[0011](2)接种菌液的准备
[0012]将步骤⑴构建的侵染性克隆I和II分别导入到农杆菌中，获得含有侵染性克隆I的农杆菌和含有侵染性克隆II的农杆菌；分别培养并收集含有侵染性克隆I和II的农杆菌菌体，用接种缓冲液重悬菌体并静置2?3h，得到用于接种红麻的接种菌液I和II ;
[0013]⑶接种处理
[0014]将步骤⑵制得的接种菌液I和II按1:1体积比混合，得到混合菌液，将混合菌液分6?8点注射接种4?5叶期的红麻植株的叶肉组织和茎干维管束组织中，然后将接种后的红麻植株继续培养；
[0015]步骤(I)中所述的植物表达载体优选为pBinPLUS或pGreen II 049 ；
[0016]步骤(I)中所述的侵染性克隆I优选为pBinPLUS-Ι.85A或pGreen II 049-1.6A ；
[0017]步骤(I)中所述的侵染性克隆I进一步优选为pBinPLUS-Ι.85A ；
[0018]步骤(I)中所述的侵染性克隆II优选为和pBinPLUS-2.0 β或pGreen II 049-2.0 β ；
[0019]步骤(I)中所述的侵染性克隆II进一步优选为和pBinPLUS_2.0f3 ；
[0020]步骤(2)中所述的农杆菌优选为EHA105或GV3101 ；
[0021]步骤(2)中所述的含有侵染性克隆I和II的农杆菌菌体优选通过如下方法获得:分别活化含有侵染性克隆I和II的农杆菌菌种，然后挑取单菌落接种于液体培养基中，28°C、180?220rpm振荡培养20?24小时，获得种子液；取种子液接种于液体培养基中，280C、180?220rpm振荡培养20?24小时，收集菌液，离心，弃上清，分别获得含有侵染性克隆I和II的农杆菌菌体；
[0022]步骤⑵中所述的接种缓冲液优选包含如下组分=1mmol.L 1MgCl2,1mmol.L 1MES,500 μ mol.L 1AS ；
[0023]步骤⑵中所述的接种菌液I和II的OD6。。值优选为0.9?1.1 ;
[0024]步骤(3)中所述的混合菌液的用量优选为0.6?ImL ；
[0025]步骤(3)中所述的红麻植株优选通过如下方法获得:将播种后的红麻种子置于26°C?28°C、16h光照/8h黑暗条件下培养，待红麻植株长至4?5叶期时用于接种；
[0026]步骤(3)中所述的红麻植株继续培养的条件优选为26°C?28°C、16h光照/8h黑暗;
[0027]步骤(3)中所述的红麻植株继续培养的时间优选为30?60天；
[0028]本发明相对于现有技术具有的优点及效果:
[0029]截止目前，国内外仅林林等(2010)报道通过烟粉虱传毒接种红麻的方法，至今还未见有利用农杆菌介导的侵染性克隆人工注射接种方法接种红麻的报道。主要原因有两方面:一是构建的CLCuMuV侵染性克隆对红麻不具有侵染能力；二是人工接种红麻的生育期选择不正确；三是人工接种红麻的接种部位选择不正确。
[0030]本发明正是突破上述这三个技术瓶颈，构建了对红麻具有侵染性的CLCuMuV及其β 卫星分子的侵染性克隆 pBinPLUS-1.85A 或 pGreen II 049-1.6A 及 pBinPLUS-2.0 β 或pGreen II 049-2.0 β ;通过人工注射接种方法，将侵染性克隆接种到4?5叶期的红麻，实现CLCuMuV对红麻的侵染，接种效率达到30% (比Briddon等用基因枪法接种棉花的效率高一倍以上)。与现有技术相比，该方法不需昂贵的仪器、操作简单、重复性好、效率较高，且不会出现其他病毒等交叉污染，适合于大规模样品的处理。
【附图说明】
[0031]图1是利用农杆菌介导的侵染性克隆接种法接种红麻的症状表现结果分析图；其中，A:pBinPLUS-l.85A 和 pBinPLUS-2.0 β 混合接种(60d) ；B:pBinPLUS-l.85A 和pBinPLUS-2.0 β 混合接种(3Od) ;C:pBinPLUS_l.85Α 单独接种(3Od) ；D:pBinPLUS-2.0 β单独接种(30d) ;E:健康红麻植株(对照)。
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0033]实施例1
[0034]CLCuMuV及β卫星分子侵染性克隆的构建
[0035]CLCuMuV的侵染性克隆pBinPLUS-Ι.85A、pBinPLUS-2.0 β (侵染广东黄秋葵的双生病毒分子特征及其侵染性克隆构建，硕士论文，甘肃农业大学，2010)由广东省农业科学院植物保护研究所蔬菜病害研究室构建。
[0036]以木尔坦棉花曲叶病毒广东分离物基因组DNA(GenBank:FJ770370)为模板，用引物 OPAL:5’ -GGTACCTCCCAGATATATGCGCCAT-3’(引入 Kpn I 位点)和 OPAR:5’ -GGTACCAAATCCCCTTTATTTCAAG-3’(含Kpn I位点)进行PCR扩增，获得I倍全长DNA-A，测序验证无误后，选取序列本身带有的Sal I酶切位点和引入Kpn I酶切，获得0.85A，插入经同样酶切的植物表达载体pBinPLUS，得到克隆pBinPLUS-Ο.85A。然后用Kpn I酶切全长1.0A，插入经同样酶切的pBinPLUS-Ο.85A，通过酶切筛选正向重复，获得含有1.85个拷贝的正向重复全长基因组的侵染性克隆pBinPLUS-Ι.85A。同样以木尔坦棉花曲叶病毒广东分离物基因组DNA(GenBank:FJ770371)为模板，以相邻反向引物 β 05:5’-GAATTCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ (引入 EcoR I 位点)和 β 02:5’-GGTACCTACCCTCCCAGG GGTACAC-3’ (引入 Kpn I 位点)进行PCR扩增，测序验证无误后，将该克隆经EcoR I和Kpn I酶切，插入经同样酶切的植物表达载体pBinPLUS，得到克隆pBinPLUS-L 0β。以相邻反向引物β 01:5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ (引入 Kpn I 位点)和 β 02:5’-GGTACCTACCCTCCCAGG GGTACAC-3?(引入Kpn I位点)进行PCR扩增，测序验证无误后，用Kpn I酶切β 01和β 02扩增获得的全长及pBinPLUS-Ι.0 β，通过酶切筛选正向重复，获得含有2.0个拷贝的正向