重复全长基因组的侵染性克隆pBinPLUS-2 β。
[0037]CLCuMuV 的侵染性克隆 pGreen II 049-1.6A 和 pGreen II 049-2.0 β (木尔坦棉花曲叶病毒及其伴随的β卫星分子复合侵染引起广东棉花曲叶病，中国农业科学2015,48(16):3166-3175)由广东省农业科学院植物保护研究所蔬菜病害研究室构建。
[0038]以木尔坦棉花曲叶病毒红麻分离物HN08 (GenBank: KF444948)为模板，用引物HNAFl:5’ -AAGCTTGTCATCAATGACGTTGTACCAGG-3’ (引入 Hind III位点)和 HNARl:5’ -GTCGACCCGCATTTCCTCAAACACT-3’(含 Sal I 位点)进行 PCR 扩增，获得 1.0 倍全长 DNA-A，用引物 HNAF2:5’ -GTCGACGTCATCAATGACGTTGTACC-3’(含 Sal I 位点)和 HNAR2:5’ -GGTACCCGCGAACTAAAAAGAACATGACCG-3’ (引入 Kpn I 位点)进行 PCR 扩增，获得 0.6 倍全长 DNA-A，测序验证无误后，用Sal I和Hind III双酶切pGEM_l.0A获得1.0倍DNA-A，插入经同样双酶切的植物表达载体pGreen II 049上，得到克隆pGreen II 049-1.0A ;用Sal I和Kpn I双酶切获得0.6倍DNA-A，插入经同样双酶切的pGreen II 049-1.0A上，获得含有1.6个拷贝的正向重复全长基因组的侵染性克隆pGreen II 049-1.6A。以木尔坦病毒红麻分离物 HN08 (GenBank:KF444949)为模板，用引物 HN0F1:5’ -GGATCCTATACATGGGTTTGTACCGTA-3’ (引入 BamH I 位点)和 ΗΝβ Rl:5’ -AAGCTTTCAAGCCAACATCCCAAC-3’ (含 Hind III位点)进行PCR扩增，获得1.0倍全长β卫星分子，用引物HNβ F2:5’ -AAGCTTTATACATGGGTTTGTACCG-3’ (含 Hind III位点)和 ΗΝβ R2:5’ -GGTACCTCAAGCCAACATCCCAAC-3’ (引入 Kpn I 位点)进行PCR扩增，获得1.0倍全长β卫星分子，测序验证无误。用Hind III和BamH I进行双酶切获得1.0倍β分子，插入经同样双酶切的植物表达载体pGreen II 049，得到克隆pGreen II 049-1.0 β。用Hind III和Kpn I进行双酶切获得1.0倍β分子，插入经同样双酶切的pGreen II 049-1.0 β，获得含有2.0个拷贝的正向重复全长β分子的侵染性克隆pGreen II 049-2.0 β。
[0039]实施例2
[0040]CLCuMuV及β卫星分子侵染性克隆接种红麻
[0041](I)实验材料
[0042]CLCuMuV的侵染性克隆pBinPLUS-Ι.85A、pBinPLUS-2.0 β，由广东省农业科学院植物保护研究所蔬菜病害研究室构建；
[0043]CLCuMuV 的侵染性克隆 pGreen II 049-1.6A 和 pGreen II 049-2.0 β，由广东省农业科学院植物保护研究所蔬菜病害研究室构建；
[0044](2)实验方法
[0045]在50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB培养基平板上活化从_80°C冰箱中取出含有 pBinPLUS-L 85A、pBinPLUS_2.0 β 的农杆菌 ΕΗΑ105 菌株和含有 pGreen II 049-1.6A、pGreen II 049-2.0 β的农杆菌GV3101菌株，28 °C培养48小时后，挑取单菌落接种于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的5mL LB液体培养基中，28 °C 220rpm振荡培养24小时，取0.5mL此菌液接种于50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的10mL LB液体培养基中，280C 220rpm振荡培养24小时，最后收集菌液，6000rpm离心8分钟，弃上清，用接种缓冲液(1mmol.L 1MgCl2, 1mmol.L 1MESJOO μ mol.L 1AS)将菌液 0D_调整为 1.0 左右，静置2?3h后，将含pBinPLUS-1.85A、pBinPLUS-2.00的农杆菌单独或等体积(I: I)混合及pGreen II 049-1.6A、pGreen II 049-2.0 β的农杆菌单独或等体积(I: I)混合分别注射接种4?5叶期的红麻植株的叶肉组织和茎干维管束组织中，每株分6?8点注射，每处理接种10株。接种植株置于26°C?28°C、16h光照/Sh黑暗条件下培养，观察发病情况。
[0046](3)实验结果
[0047]接种后30d，pBinPLUS-Ι.85A和pBinPLUS-2.0 β单独接种的10株红麻植株均没有表现出明显症状，而pBinPLUS-Ι.85A和pBinPLUS-2.0 β混合接种的10株红麻中有3株顶部新出叶片开始表现向上卷曲、叶脉稍肿大等症状；随着时间推移，显症红麻植株的其他叶片也陆续卷曲。接种后60d，显症植株的绝大多数叶片均卷曲、叶脉明显肿大等症状，与田间红麻曲叶病株的症状相同(图1)，人工接种的效率为30%。
[0048]接种后30d，pGreen II 049-1.6A 和 pGreen II 049-2.0 β 单独接种的 10 株红麻植株均没有表现出明显症状，而pGreen II 049-1.6A和pGreen II 049-2.0 β混合接种的10株红麻中有I株顶部新出叶片开始表现向上卷曲、叶脉稍肿大等症状；随着时间推移，显症红麻植株的其他叶片也陆续卷曲。接种后60d，显症植株的绝大多数叶片均卷曲、叶脉明显肿大等症状，与田间红麻曲叶病株的症状相同，人工接种的效率为10 %。
[0049]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于包括如下步骤: (1)侵染性克隆的构建 将木尔坦棉花曲叶病毒1.3?2.0个拷贝的正向重复全长基因组和2个拷贝的正向重复β卫星分子分别构建到植物表达载体上，得到含有1.3?2.0个拷贝的正向重复全长基因组的侵染性克隆I和含有2个拷贝的正向重复β卫星分子的侵染性克隆II ; (2)接种菌液的准备 将步骤(I)构建的侵染性克隆I和II分别导入到农杆菌中，获得含有侵染性克隆I的农杆菌和含有侵染性克隆II的农杆菌；分别培养并收集含有侵染性克隆I和II的农杆菌菌体，用接种缓冲液重悬菌体并静置2?3h，得到用于接种红麻的接种菌液I和II ; (3)接种处理 将步骤⑵制得的接种菌液I和II按1:1体积比混合，得到混合菌液，将混合菌液分6?8点注射接种4?5叶期的红麻植株的叶肉组织和茎干维管束组织中，然后将接种后的红麻植株继续培养。2.根据权利要求1所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的植物表达载体为pBinPLUS或pGreen II 049。3.根据权利要求2所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的侵染性克隆I为pBinPLUS-Ι.85A或pGreen II 049-1.6A ； 步骤(I)中所述的侵染性克隆II为和pBinPLUS-2.0β或pGreen II 049-2.0 β。4.根据权利要求3所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的侵染性克隆I为pBinPLUS-Ι.85A ； 步骤(I)中所述的侵染性克隆II为和pBinPLUS-2.0β。5.根据权利要求1所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤⑵中所述的农杆菌为ΕΗΑ105或GV3101。6.根据权利要求1所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的含有侵染性克隆I和II的农杆菌菌体通过如下方法获得:分别活化含有侵染性克隆I和II的农杆菌菌种，然后挑取单菌落接种于液体培养基中，28°C、180?220rpm振荡培养20?24小时，获得种子液；取种子液接种于液体培养基中，28 °C、180?220rpm振荡培养20?24小时，收集菌液，离心，弃上清，分别获得含有侵染性克隆I和II的农杆菌菌体。7.根据权利要求1所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的接种缓冲液包含如下组分:1mmol.L 1MgCl2, 1mmol.L 1MES,500 μ moI.L 1AS08.根据权利要求1所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的红麻植株通过如下方法获得:将播种后的红麻种子置于26°C?28°C、16h光照/8h黑暗条件下培养，待红麻植株长至4?5叶期时用于接种。9.根据权利要求1所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的红麻植株继续培养的条件为26°C?28°C、16h光照/8h黑暗。10.根据权利要求1所述的木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的红麻植株继续培养的时间为30?60天。
【专利摘要】本发明属于植物保护领域，特别涉及一种木尔坦棉花曲叶病毒侵染红麻的接种方法。本发明通过人工注射法将农杆菌介导的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆接种到4～5叶期的红麻植株的叶肉组织和茎干维管束组织中，进而实现木尔坦棉花曲叶病毒对红麻侵染，该方法与目前对木尔坦棉花曲叶病毒的致病性研究常采用的基因枪轰击法相比，具有无需专业仪器、操作简单，结果准确、重复性好、成本低等特点，是一种简便、经济而有效的接种方法。
【IPC分类】C12N15/84
【公开号】CN105219801
【申请号】CN201510757230
【发明人】何自福, 汤亚飞, 佘小漫, 蓝国兵
【申请人】广东省农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月6日