一种转录终止子及其在基因克隆中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学和基因工程领域。具体的讲，本发明设及一种转录终止子 序列及含有该转录终止子的克隆载体在基因克隆领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 20世纪70年代，基因工程技术的出现，标志着人类认识和改造生命新时期的到 来，建立和发展了重组DNA技术。重组DNA技术是指在体外将含有目的基因或其它有意义 的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达 或进一步研究的分子操作的过程；重组DNA技术又称分子克隆，基因操作或DNA克隆，其设 及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体 外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。
[000引转录终止子（terminator)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个 操纵单元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。在真核生物中，转录终 止子是一种位于POly(A)位点下游，长度在数百碱基W内的结构；在原核生物中，发现终止 信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。转录终止子可分为两类：一类依赖蛋白辅 因子才能实现终止作用，运种蛋白质辅因子通常称为P因子巧ho因子）；一类不依赖于蛋 白质辅因子就能实现终止作用；运类终止子在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC 的反向重复序列（invertedr巧eatsequence),其后跟随一段富含AT的序列因而转录生成 的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的运段mRNA 的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动，并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。
[0004] 化0因子负责细胞内大约20%的转录终止；化0因子非依赖型的转录终止占80% 左右。目前，人们对于第一类转录终止子的详细机理研究的还不是很透彻，更多的是集中在 对第二种转录终止子的研究上，此种类型的转录终止子序列通常可W作为独立的元件应用 于合成生物学中，可W用来终止不必要的转录起始。
[0005] 有关不必要的转录起始概念的提出，源于一些较早的毒性基因的克隆实验。在研 究中发现，一些克隆到T7表达系统中的毒性基因不仅在宿主菌化21 0E3)中不能稳定存 在，而且在不带有T7RNA聚合酶来源的大肠杆菌中也不能存在。运个现象可能的解释是毒 性基因被大肠杆菌中的RNA聚合酶通读下来了。在毒性基因启动子的上游可能存在一些隐 秘的启动子，他们能够被大肠杆菌的RNA聚合酶识别并起始转录，产生的mRNA的量也许不 多，但产生足W对细胞产生明显毒性的蛋白。为了解决转录通读的运个问题，在毒性基因的 启动子上游加上强有效的转录终止子能够有效解决上述出现的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有克隆载体的缺陷，提供一种含有人工合成转录终止子 的克隆载体及其制备，并将其用于大量的克隆实验中。
[0007] 本发明的载体WPUC57载体为骨架，连入人工合成的转录终止子载体，采用绿色 巧光蛋白为报告基因，W能否明显抑制巧光蛋白基因的转录与否来验证转录终止子的效 率；同时将连有该转录终止子序列的PUC57载体用于克隆实验，证实其可W作为毒性基因 或者困难基因的克隆备用载体来替代PUC57载体。
[0008] 本发明的研究围绕一种转录终止子的应用展开，所述转录终止子编码链的序列 为：
[0010] 进一步的，所述转录终止子两端为平端，或者所述转录终止子的两端还包括粘性 末端。
[0011] 所述粘性末端主要用于连接载体。粘性末端可根据需要克隆入载体的位置所对应 的酶切位点设计。如本发明实施例列举的，可为对应化ndIII和PstI酶切后的粘性末端， 或为对应EcoRI和化nI酶切后的粘性末端。
[0012] 本发明第一方面提供了一种含有本发明转录终止子的克隆载体。
[0013] 进一步的，所述克隆载体为大肠杆菌克隆载体，所述大肠杆菌克隆载体的多克隆 位点克隆有所述转录终止子。
[0014] 所述克隆载体的骨架可为PU巧7,也可为其他常见的大肠杆菌克隆载体。
[0015] 如实施例列举的，所述克隆载体WPUC57为骨架载体，转录终止子序列位于该载 体的多克隆位点区域中。
[0016] 具体的，所述克隆载体是将所述转录终止子通过EcoRI和化nI位点克隆入 PUC57载体获得。
[0017] 本发明的克隆载体依然含有多克隆位点，能够广泛用于基因克隆实验。
[0018] 本发明第二方面，提供了所述克隆载体在基因克隆领域的用途。
[0019] 进一步的，将所述克隆载体用于毒性基因或困难基因的克隆。
[0020] 所述毒性基因是指：表达后可直接或间接杀死宿主细胞的基因。
[0021] 具体的，如实施例列举，所述毒性基因可W为毒性基因CC地。
[0022] 所述困难基因是指：在普通大肠杆菌载体中难W克隆成功的基因。所述普通大肠 杆菌载体可W为PUC57等。如本发明实施例列举，所述困难基因可为序列为SEQIDNO. 2 的大豆花叶病毒多聚蛋白前体基因，或者编码序列为SEQIDNO. 3的大豆花叶病毒多聚蛋 白基因。
[0023] 本发明第=方面，提供了一种毒性基因或困难基因的克隆方法，为W本发明的克 隆载体为载体，将所述毒性基因或困难基因克隆入所述克隆载体多克隆位点中的转录终止 子的下游。
[0024] 本发明第四方面，提供了一种载体，为在本发明的克隆载体的多克隆位点中克隆 入外源基因获得，所述外源基因选自绿色巧光蛋白基因、编码序列为SEQIDNO. 2的大豆花 叶病毒多聚蛋白前体基因或编码序列为SEQIDNO. 3的大豆花叶病毒多聚蛋白基因，所述 外源基因位于本发明的转录终止子的下游。
[00巧]本发明第五方面，提供了一种验证本发明转录终止子转录效果的方法，包括下列 步骤：
[0026] 1)将绿色巧光蛋白GFP的编码基因克隆到PUC57载体的多克隆位点，并位于 pUC57载体lac启动子的下游；
[0027] 2)将本发明的转录终止子及绿色巧光蛋白GFP的编码基因均克隆入PU巧7载体的 多克隆位点，所述转录终止子序列插入到Iac启动子的下游，绿色巧光蛋白起始密码子的 上游区域；
[0028] 3)将步骤1)和2)获得的载体分别转化大肠杆菌感受态细胞，将经转化的感受态 细胞分别涂布含有IPTGA-Gal的氨节青霉素平板，在自然光下或者紫外光下观察菌落能 否呈现绿色巧光和巧光强度的变化程度，通过巧光强度的变化来反映转录终止子的效率。
[0029] 本发明的转录终止子具有有效的转录终止效果，将其序列克隆到载体中，构建的 载体，能够有效的终止载体上隐秘的转录起始，使得该载体能够用于毒性基因或困难基因 的克隆。因此，本发明的转录终止子序列能够广泛用于大肠杆菌克隆载体且本发明构建的 重组载体能够广泛用于基因克隆实验。
【附图说明】
[0030] 图1粘性末端为化ndIII和PstI的酶切后序列的转录终止子序列TTl与pU巧7 载体连接后PCR检测的电泳图
[0031] 图2插入了转录终止子和不含有转录终止子的载体对GFP蛋白转录水平的影响
[0032] 图3粘性末端为EcoRI和化nI酶切后序列的转录终止子TT邸与PUC57载体连 接后PCR检测的电泳图
[0033] 图4CC地基因稳定存在于TT邸-PUC57载体中的测序结果峰图
[0034] 图5困难基因EF克隆至TT邸-PUC57载体的酶切检测图
[0035] 图6困难基因GH克隆至TT邸-PUC57载体的酶切检测图
[0036] 图7困难基因EF和GH克隆至TT邸-pUC57载体的PCR检测电泳图
【具体实施方式】
[0037] 本发明采用化学合成的方式先合成引物，并通过引物中碱基的互补配对来获得完 整的转录终止子序列。
[003引如实施例列举的，含有本发明转录终止子的克隆载体可采用下列方法制备：
[0039] A.通过合成引物及退火获得两端带有化ndIII和PstI酶切位点的转录终止子 序列。
[0040] B.用化ndIII和PstI酶切消化PUC57载体，将退火后的片段和载体连接后得到 含有转录终止子的克隆载体。
[0041] 实施例还W绿色巧光蛋白为报告基因，将转录终止子序列插入到Iac启动子的下 游，绿色巧光蛋白起始密码子的上游区域，证明其能够有效的抑制报告基因的转录，使菌落 在自然光或者紫外光下呈现的绿色巧光明显减弱。
[0042] 具体的，所述转录终止子效率的验证方法可包括下列步骤：
[0043] A.通过合成引物进行PCR或全基因合成获得编码绿色巧光蛋白GFP的编码链和互 补链。所述绿色巧光蛋白的基因序列如下：
[0045] B.通过产生平末端的内切酶Sma I将绿色巧光蛋白GFP的编码基因通过平末端 连接克隆到PUC57载体中；将获得的载体转化大肠杆菌D册a感受态细胞，涂布含有IPTG/ X-Gal的氨节青霉素平板，获得的平板菌落在自然光下和紫外光下能够观察到明显的绿色 巧光。
[0046] C.利用产生平末端的内切酶Sma I将绿色巧光蛋白GFP的编码基因通过平末端连 接克隆到含有本发明转录终止子的PUC57克隆载体中；将获得的载体转化大肠杆菌D册a 感受态细胞，涂布含有IPTG/X-Gal的氨节青霉素平板，在自然光下或者紫外光下观察菌落 能否呈现绿色巧光和巧光强度的变化程度。通过巧光强度的变化来反映转录终止子的效 率。
[0047]W下列举具体实施例进一步阐明本发明，但实例并非用于限制本发明的保护范 围。本领域技术人员可W借鉴本文内容，对适当载体进行改造W适应特殊的用途。特别需 要指出的是，所有类似的替换或者改动都被视为包括在本发明。
[0048] 实施例中，转化用大肠杆菌D册a感受态细胞采用的是氯化巧法制备的；所 用限制性内切酶、连接酶等、PUC57载体及DNAmarkerSM0331均购自ThermoFisher Scientific公司。常规试剂均采用生工生物工程（上海）股份有限公司产品。扩增绿色巧 光蛋白GFP基因和CC地基因（由生工生物工程（上海）股份有限公司通过全基因合成的 方法合成）
[0049] 实施例1转录终止子序列的合成
[0050] 本实施例中所用转录终止子命名为TT1，序列如下：
[0051]TTl：
[0052]编码链：（沈Q ID NO:5)
[0056] 下划线部分是用于与酶切后的载体连接的粘性末端区域。
[0057] 设计如下引物：
[0058]TTl-Fl:(SEQID NO: 7)
[0059] 5' -AGCTTGCGGCCGCTTCTAGAGAAAAAAAAACCCCGCCCCT-3，
[0060]TT1-F2:(SEQID NO:8)
[0066] 使用化学合成法完成引物的合成，合成好的引物溶于水使其终浓度为10ymol/l， 每条引物各取2yL进行退火，按照如下体系和程序进行退火处理：
[0067] 10x1