专利名称：一种培育耐草甘膦转基因玉米的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育耐草甘膦转基因玉米的方法。
背景技术：
目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，如I) AT含量较高，超过60 %，造成基因表达的mRNA在植物体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5’ -UTR序列和3’末端的 PolyA加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0. 001%或者几乎检测不到。美国 Monsanto 公司的 Perlak(Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A,et al. Modification of the coding SEQ ID NO. uence enhances plant expressingof insect control protein genes. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 :3324-3328)和 Iannacone 等(Iannacoe R, Grieco P D, Cellini F. Specific SEQ ID NO. uencemodification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression andinsect resistance. Plant Mol Biol,1997,34 :485-496)在不改变毒蛋白氛基酸序列的前提下，分别对杀虫蛋白基因和cryIII基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不稳定元件序列，使转基因植株中毒蛋白的表达量增加了 30 100倍，高达可溶性蛋白的0. 02 1%，获得了明显的抗虫效果。杂草是农作物生产的大害，自1942年出现近代杂草防治技术以来，化学除草剂有了很大的发展。草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS (5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入玉米，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护玉米免受药害，最终达到增产增收的目的。尽管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被发现，并在宿主荧光假单胞菌G2及大肠杆菌中都能高效表达,表现高耐草甘膦的特性(Yichen Sun,Min Linand Yiping Wang. Novel AroA with high tolerance to Glyposate, encoded by a geneof Pseudomonas putida 4G—1 isolated from an extremeIypoIluted environment inChina. Aplied and environmental microbiology. 2005, 71 (8) :4771-4776),但其在植物,特别是重要的粮食作物中由于表达量较低而没有被利用，因此急需对其在植物中的应用进行研究，如进行密码子优化，以加速其应用到农业生产中。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育耐草甘膦转基因玉米的方法。本发明所提供的培育耐草甘膦转基因玉米的方法包括将耐草甘膦基因导入目的玉米，得到表达所述耐草甘膦基因的转基因玉米的步骤；所述转基因玉米与所述目的玉米相比，对草甘膦的耐受性提高；所述耐草甘膦基因是编码序列9所示蛋白质的基因。其中，所述耐草甘膦基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果I)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持耐草甘膦蛋白的氨基酸序列不变的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物 中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60% ；2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。本发明中，所述耐草甘膦基因具体为下述a)或b)的DNA分子a)核苷酸序列为序列表中序列2 ；b)核苷酸序列与序列表中序列2至少具有98%的同一性，且编码序列9的蛋白质(命名为G2-aroA蛋白)。在本发明的一个实施例中，所述将耐草甘膦基因导入目的玉米是通过将表达所述耐草甘膦基因的重组DNA片段导入所述目的玉米完成的。所述重组DNA片段通过重组表达载体导入所述目的玉米。本发明中所述重组DNA片段均指能够在宿主细胞中表达序列表中序列9所示蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动所述耐草甘膦基因转录的启动子，还可包括终止子。进一步，所述重组DNA片段还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子；四环素诱导型启动子；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128,种子忙存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin, oleosin和大豆betaconglycin的启动子等。可用于本发明的转录终止子包括但不限于农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的植物表达载体构建表达所述耐草甘膦基因的所述重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pR0KII、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中启动所述耐草甘膦基因转录的启动子为Ubi启动子；所述Ubi启动子的序列为序列表中序列5，或与序列5至少具有80%的同一性，且具有启动子功能。在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中终止所述耐草甘膦基因转录的转录终止序列如序列表中序列8的第216-491位所示，或与序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有转录终止功能。在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段和所述重组表达载体中还包括由Ω序列和Kozak序列顺次连接而成的OMK序列；所述OMK序列如序列表中序列6所示，或与序列6至少具有80%的同一性，且具有增强子功能。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中还包括叶绿体导肽(CTP)序列；所述叶绿体导肽(CTP)序列如序列表中序列7所示，或与序列7至少具有80%的同一性，且具有信号肽功能。在本发明的一个实施例中，所述重组DNA片段由所述Ubi启动子、所述OMK序列、所述叶绿体导肽序列、所述耐草甘膦基因和所述转录终止序列顺次连接组成，命名为Ub i -0MK-CTP-mG2aroA-Po I yA-T-NOS，其序列为序列表中序列 IO。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体含有所述重组DNA片段，将该重组表达载体命名为PS3300-UMG2，其序列为序列表中序列11。其中，序列I由1335个核苷酸组成，其末尾处为一个终止密码子。序列2由1338个核苷酸组成，其末尾处为两个终止密码子。序列I和序列2的第1-1335位均为编码序列，均编码序列表中序列9所示的G2-aroA蛋白。序列5由2010个和核苷酸组成。序列6由67个核苷酸组成。序列7由141个核苷酸组成。序列8由491个核苷酸组成。序列10由4058个核苷酸组成，其中第1-2010位为Ubi启动子序列，第2022-2088位为OMK序列，第2089-2229位为叶绿体导肽(CTP)序列，第2230-3567位为mG2_aroA序列，第3568-4058位为转录终止序列。序列11由10488个核苷酸组成，其中第151-2165位为Ubi启动子序列，第 2177-2243 位为 OMK 序列，第 2244-2384 位为 CTP 序列，第 2385-3722 位为 mG2_aroA序列，第3723-4213位为转录终止序列。所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。利用本发明所提供的培育耐草甘膦转基因玉米的方法培育得到的转基因玉米也属于本发明的保护范围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。在本发明的实施例中，所述玉米具体为玉米品种综31。本发明针对原核生物耐草甘膦基因G2-aroA在植物中表达较低的问题，在保持原氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好性密码子对其进行优化，去除影响RNA稳定性的结构(如polyA、重复序列、AT和GC串联重复、RNA 二级结构、核糖体结合位点等)，增加GC含量，使G2-aroA蛋白在玉米中高效稳定表达。 实验证实，利用本发明所提供的培育耐草甘膦转基因植物的方法，培育得到的转入mG2-aroA基因(序列2)的阳性玉米植株，与转入原始G2_aroA基因的玉米植株相比，其G2-aroA蛋白的表达量明显提高，每克叶片G2_aroA蛋白的表达量中可达15. 057 μ g，远高于原始G2-aroA基因转基因玉米的3. 735 μ g。同时，与转入原始G2_aroA基因的玉米植株相比，转入mG2-aroA基因的阳性玉米植株对草甘膦的耐受性也明显提高，转入mG2-aroA基因的T6代植株，在玉米5叶期喷施800ml/亩农达后，无明显的药害，表现正常，后期的生长期内均无药害反应；而转入含有G2-aroA基因的的T6代植株，在800ml/亩农达处理后，药害非常严重，植株均表现黄化、畸形，后期植株生长期内大部分表现雄穗不分化、雌穗不吐丝或者植株矮小。
图I为载体pUC19-UG2的质粒图谱。图2为载体pCAMBIA3300的质粒图谱。图3为载体pS3300的质粒图谱。图4为重组表达载体pS3300-UG2的质粒图谱。图5为重组表达载体pS3300-UMG2的质粒图谱。图6为重组载体pS3300-UG0的质粒图谱图7为T6代G2_aroA转基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道I为阳性对照；泳道2为DNA Marker (D2000);泳道3为空白对照组；泳道4为未转基因的玉米植株(阴性对照2);泳道5-15为11株转入G2-aroA基因的T6代转基因玉米植株。图8为T6代mG2-aroA转基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道I为阳性对照；泳道2为DNA Marker (D2000);泳道3为空白对照组；泳道4为未转基因的玉米植株(阴性对照2);泳道5-24为20株转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米植株。图9为T6代G2_aroA转基因玉米植株和T6代mG2_aroA转基因玉米植株的草甘膦耐性田间鉴定图。其中，A为mG2-aroA转基因玉米植株、空载体转基因植株和未转基因植株；B为mG2-aroA转基因玉米植株和G2_aroA转基因玉米植株。A和B中，I所示一行玉米为mG2-aroA转基因玉米植株；2所示一行玉米为G2_aroA转基因玉米植株；3所示一行玉米为空载体转基因玉米植株；4所示一行玉米为未转基因的玉米植株。图10为双抗夹心ELISA检测G2_aroA蛋白浓度的标准曲线。
图11为纯化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图。其中，泳道I为蛋白Marker，自上到下依次为72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均为原核重组表达载体pET-28a-G2_aroA中表达后纯化所得的G2-aroA蛋白，上样量分别为5 ill、10 ill、15 ill。图12为SDS-PAGE检测纯化后单克隆抗体的纯度。其中，泳道I为蛋白Marker ；泳道2为纯化后的单克隆抗体，较大的目的条带为重链，较小的目的条带为轻链。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、密码子优化型耐草甘膦基因的获得本实施例根据G2_aroA基因(中国专利，申请号03826892. 2，授权公告号CN100429311C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列I所示)，在保证氨基酸序列不变的前提下，首先采用玉米偏好密码子对G2-aroA基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有密码子，并调整了密码子的使用频率(表I)，使G2-aroA蛋白的密码子使用频率与玉米中的使用频率接近(表I)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核苷酸序列为序列表中序列
2。序列2与G2-aroA基因(序列I)同源性只有84%，而G+C含量由原来的64. 83%降低到62. 07%。序列2所示基因即为密码子优化型耐草甘膦基因，将其命名为mG2-aroA。密码子在玉米、G2-aroA基因和mG2-aroA基因中的使用频率见表I。为方便克隆，发明人在序列2的5’端引入BamH I酶切位点，在3’端引入KpnI酶切酶切位点，最终序列如序列表中序列3所示。序列3的第7-1344位即为序列2。序列I、序列2的第1-1335位，以及序列3的第7-1341位均编码序列，均编码序列表中序列9所示蛋白，将该蛋白命名为G2-aroA蛋白。表I玉米优选密码子标准权利要求
1.一种培育耐草甘膦转基因玉米的方法，包括将耐草甘膦基因导入目的玉米，得到表达所述耐草甘膦基因的转基因玉米的步骤；所述转基因玉米与所述目的玉米相比，对草甘膦的耐受性提高；所述耐草甘膦基因为下述a)或b)的DNA分子 a)核苷酸序列为序列表中序列2； b)核苷酸序列与序列表中序列2至少具有98%的同一性且编码序列9的蛋白质。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述将耐草甘膦基因导入目的玉米是通过将表达所述耐草甘膦基因的重组DNA片段导入所述目的玉米完成的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述重组DNA片段通过重组表达载体导入所述目的玉米。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述重组DNA片段和所述重组表达载体中启动所述耐草甘膦基因转录的启动子为Ubi启动子；所述Ubi启动子的序列为序列表中序列5，或与序列5至少具有80%的同一性，且具有启动子功能。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述重组DNA片段和所述重组表达载体中终止所述耐草甘膦基因转录的转录终止序列如序列表中序列8的第216-491位所示，或与序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有转录终止功能。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于所述重组DNA片段和所述重组表达载体中还包括由Ω序列和Kozak序列顺次连接而成的OMK序列；所述OMK序列如序列表中序列6所示，或与序列6至少具有80%的同一性，且具有增强子功能。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于所述重组DNA片段和所述重组表达载体中还包括叶绿体导肽序列；所述叶绿体导肽序列如序列表中序列7所示，或与序列7至少具有80%的同一性，且具有信号肽功能。
8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于所述重组DNA片段的序列为序列表中序列10。
9.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于所述重组表达载体的序列为序列表中序列11。
10.利用权利要求1-9所述方法培育得到的转基因玉米。
全文摘要
本发明公开了一种培育耐草甘膦转基因玉米的方法。本发明所提供的方法包括将耐草甘膦基因导入目的玉米，得到表达所述耐草甘膦基因的转基因玉米的步骤；所述转基因玉米与所述目的玉米相比，对草甘膦的耐受性提高；所述耐草甘膦基因为下述a)或b)的DNA分子a)核苷酸序列为序列表中序列2；b)核苷酸序列与序列表中序列2至少具有98％的同一性且编码序列9的蛋白质。利用本发明所提供的方法培育得到的、转入所述耐草甘膦基因的转基因玉米，与转入所述原核生物耐草甘膦基因G2-aroA的转基因玉米相比，其G2-aroA蛋白的表达量明显提高；同时对草甘膦的耐受性也明显提高。
文档编号C12N15/63GK102643804SQ201210107400
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者刘素霞, 李雪峰, 王长成, 邓德芝, 韩宝柱, 韩庚辰 申请人:北京奥瑞金种业股份有限公司