专利名称：用于检测eml4-alk融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及融合基因突变的检测试剂盒。
背景技术：
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各癌症之首。每年全世界有超过130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。据2010年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30. 83/10万，肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。(Orras JM, Fernandez E, Gonzalez JR, et al. Lung cancer mortality in European regions (1955-1997). Ann Oncol,2003,14(1) :159-161 ;中华人民共和国卫生部，《2010 年中国卫生统计》年鉴)。肺癌从组织病理学上可以分为小细胞癌(SCLC)和非小细胞癌(non-small celllung cancer,NSCLC)两大类，其中非小细胞癌约占肺癌总病例的85%。在我国肺癌患者5年的生存率仅为13%，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相匹配科学的治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。目前化疗仍是肺癌主要治疗手段，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。EML4-ALK(EchinodermMicrotubule-associated protein-Like 4-Anaplastic Lymphoma Kinase)基因融合突变的发现为NSCLC患者提供了新的治疗靶点。EML4(棘皮动物微管相关蛋白4)与微管形成密切相关；ALK (间变性淋巴瘤激酶)在肿瘤细胞信号转导起着重要的调节作用。EML4主要包含卷曲螺旋结构、疏水EMAP蛋白结构域、色氨酸-天冬氨酸重复结构；EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和P23带，相隔约12Mb。这两个基因片段的倒位融合，即inv(2) (p21p23)能够使得组织表达新的EML4-ALK融合蛋白。融合后的EML4启动子位于ALK酪氨酸激酶的上游，从而使融合基因活化，表达EML4-ALK融合蛋白。通过EML4胞外结构形成的二聚体使ALK受体持续磷酸化,进而激活持续下游的细胞信号通路(Soda Μ,et al. Nature 2007 ；448 :561-6 ；Martelli MP, et al. Am. J. Pathol. 174 (2) :661-70 ;KohY, et al.J Thorac Oncol 2011 ；6 :905-912.)。以Crizotinib (克里唑蒂尼，Pfizer)为代表的药物是针对EML4-ALK基因融合突变开发的小分子靶向药物，通过抑制ALK酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。临床研究表明Crizotinib对EML4-ALK融合突变患者的有效率可达61 %以上，而对野生型的患者几乎没有疗效。因此，检测EML4-ALK融合突变情况是指导Crizotinib类药物用药的前提和基础，在化疗之前通过高灵敏的检测方法检测EML4-ALK融合基因突变对于提高肺癌患者的生存率，延长生存期、避免过度化疗、提高生存质量有着重要意义。目前，EML4-ALK融合突变的检测方法主要为荧光原位杂交(FISH)法，然而，FISH法检测特异性差，灵敏度较低，检测时间长，而且无法同时检测EML4-ALK融合产生的多种融合变异体。此外，FISH检测需要昂贵的专用仪器设备，试剂成本较高，操作复杂，使临床检测广泛使用受到了限制。FISH检测要求检测样本保存的时间不宜太长，采用保存时间长的样本进行检测会导致假阴性的发生，影响了检测的准确性。因此，FISH检测法无法满足临床医生检测实际应用的需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度的可以同时检测EML4-ALK融合基因多种突变的检测方法，以实现采用快速的检测方法对EML4-ALK多种融合突变进行同时检测，从而为临床肺癌个体化治疗方案提供科学参考依据。针对上述问题，本发明开发一种快速廉价、操作简便的EML4-ALK融合基因突变检测试剂盒及检测方法。本检测方法设计运用一种新型特异引物和探针。本检测方法可以一次同时检测EML4与ALK基因的9种融合突变，检测灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，廉价快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实际需求
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于EML4-ALK基因融合突变检测引物和探针，其特异引物与探针包括如下序列表1EML4-ALK融合突变特异性双弓I物和探针核苷酸序列EM.4-ALK-反转录 I :TCAGGTCACTGATGGAGGAGSEQ ID NO 01
EM.4-ALK-逆转录 2 CAGGAGGAGCAATGATCTTGSEQ ID NO 02I 号M 1、2、3EM^-ALK-M-FiGCCCACACCTGGGMAGGACCTSEQ ID NO :03EM.4-ALK-M-F CAGACAAGCATAAAGATGTCATSEQ ID NO :04EM.4-ALK-M-F ACACCTTGACTGGTCCCCAGACSEQ ID NO :05EM.4-ALK-M-R AGGTGCGGAGCTTGCTCAGCTSEQ ID NO :06EM.4-ALK-M-P FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQlSEQ ID NO :072 号M4、5EM.4-ALK-M-F GCAGAAGGAAAGGCAGATCAATSEQ ID NO :08EM.4-ALK-M-F TCTGTGGGATCATGATCTGAATCSEQ ID NO 09EM.4-ALK-M-R TCAGGTCACTGATGGAGGAGGTCSEQ ID NO :10E14-ALK-M-P :FAM-5-TGTATGAC0GACTACMCCCCMCTACTGGGT-3-BHQlSEQ ID NO :113 号M 6、7EM^-ALK-M-FiCCAGAGATCTAGTTTCTATCCACSEQ ID NO :12EM.4-ALK-M-F ATCTCTGAAGATCATGTGGCCTCSEQ ID NO :13EM^-ALK-M-RiAGGTGCGGAGCTTGCTCAGCTSEQ ID NO :14EM.4-ALK-M-P FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQlSEQ ID NO :154 号M 8EM^-ALK-M-FiATAGGMCGCACTCAGGCAGAGSEQ ID NO :16EM^-ALK-M-RiAGGTGCGGAGCTTGCTCAGCTSEQ ID NO :17EM.4-ALK-M-P FAM-5-AGCTCACCAGGAGCTGCAAGCCATGCTTGC-3-BHQlSEQ ID NO :18
5 号M 9EM.4-ALK-M-F ATCTCTGAAGATCATGTGGCCTCSEQ ID NO :19EM.4-ALK-M-R GCAGCCTGGCCCTTGAAGCACTSEQ ID NO :20EM.4-ALK-M-P FAM-5-GATCCCTCCCTGGATCTCCATATCCTCCTGGA-3-BHQlSEQ ID NO :216 号ACTB-F CTGGCATTGCOGACAGGASEQ ID NO 22ACTB-R AGGAGCAATGATCTTGATCTTCSEQ ID NO 23·ACTB-P FAM-CAGTAAGGAGATCACTGCCCTGGCACCCAAGGG-BHQSEQ ID NO :24本发明另一方面提供了一种用于检测EML4-ALK基因融合突变检测试剂盒，其PCR
反应扩增体系如下
Takara 10XPCR Buffer 稀释为 IX模板5 μι
各引物I. O 4. O pmol
各探针I. O 3. O pmol
Taq 酶O. 5 2. O U
dNTPI 2 mmol
MgCL22 3 mmol
甲酰胺I 2%
总体积25 μL本发明另一方面提供了一种用于mRNA反转录cDNA的方法，方法包括反转录体系组成以及如下操作步骤mRNA反转录cDNA体系包括如下成分
5XM-MLV buffer 5μ 引物终浓度2 ρΜ
dNTPO. 5mM
M-MLV200U
RNA6μ
补DEPC水至25μ (a)取逆转录反应混合液18 μ 1，M-MLV逆转录酶I μ 1，加入无菌离心管中，混匀。(b)加入待测样品RNA 6 μ I，RNA总量在O. I 5 μ g范围内，补水至25 μ I。(c)42°C保温I个小时。(d) 950C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板.。本发明再一方面提供一种用于检测EML4-ALK基因融合突变方法，其方法包括以下步骤
(I)根据COSMIC数据公布的人类EML4-ALK为野生型基因序列，针对EML4-ALK基因9种融合突变，来设计特异引物和探针。(2)提取检测样本的RNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或胸腔液。(3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性。本发明的有益效果是本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类EML4-ALK基因融合突变。此方法(I)建立了实时荧光PCR体系，可同时检测EML4-ALK基因9种融合突变；(2)灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；(3)操作简单，检测廉价，临床 应用范围广；(4)样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；(5)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
图I为本发明检测质粒PCR图。图2为灵敏度分析试验结果PCR图。图3为检测临床样本突变阳性PCR图。图4为检测临床样本野生型PCR图。
具体实施例方式本发明以基因工程构建的突变质粒为模板，构建EML4-ALK实时荧光PCR扩增反应体系，以FAM为突变信号检测通道，针对EML4-ALK融合突变9个位点设计特异性探针和双引物，通过引物及检测体系的优化实现高灵敏特异检测。检测EML4-ALK基因融合突变的方法包括以下步骤(I)针对突变位点设计合成引物和探针根据COSMIC数据库公布的人类EML4-ALK基因序列为野生型序列，针对EML4-ALK基因9种融合突变来设计特异性引物和探针。通过特异性引物和探针体系优化，实现高灵敏和特异检测，EML4-ALK基因9个融合突变位点见表2。针对选定的9个融合突变位点,应用Premier 6. O引物设计软件设计多对特异引物和多条探针，引物和探针序列如表I所示。(2)样本处理与RNA的提取样品处理与RNA的提取样本适用范围包括新鲜肿瘤组织和胸腔液。新鲜病理组织，取I克左右，使用TIANGEN的RNA提取试剂盒提取其RNA。胸腔液使用TIANGEN的组织RNA提取试剂盒提取其RNA。石蜡包埋组织，使用Qiagen的组织RNA提取试剂盒提取其RNA。上述具体操作步骤按试剂盒说明书操作。(3)建立PCR扩增反应体系将所提上述RNA溶于O. I % DEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度0D260/0D280为I. 9-2. 1，并读取其含量。取O. I 5 μ g的RNA作为其cDNA合成的模板，采用厦门艾德生物医药科技有限公司的试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系如下
5XM-MLV buffer5μ
引物终浓度2 ρΜ
dNTPO. 5mM
M-MLV200U
RNA6μ
补DEPC水至25μ 应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录 (a)取逆转录反应混合液18 μ 1，M-MLV逆转录酶I μ I，加入无菌离心管中，混匀。(b)加入待测样品RNA 6 μ I，RNA总量在O. I 5yg范围内，补水至25 μ I。(c)42°C保温I个小时。(d) 950C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板.。将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR
扩增
Takara 10XPCR Buffer 稀释为 IX 模板5 μι
各引物I. O 4. O pmol
各探针I. O 3. O pmol
Taq 酶O. 5 2. O U
dNTPI 2 mmol
MgCL22 3 mmol
甲酰胺I 2%
总体积25 μL实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，I个循环；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93 °C变性25秒，60 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准检测FAM荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性。以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。实施例I运用本发明体系检测质粒,实验用质粒模板(含EML4-ALK variant I突变)，利用上述荧光PCR检测EML4-ALK基因融合突变的方法如下(I)质粒处理与提取质粒的提取采用TIANGEN(HighPure Plasmid Kit, DP116)的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提DNA溶于Tris-HCl中(lOmmol/L，PH8. O)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl (10mmol/L, PH8. O)溶液调整DNA浓度到2ng/ μ L作为PCR模板，取5 μ L进行PCR反应扩增。(2)建立PCR扩增反应体系将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR
扩增
Takara 10XPCR Buffer 稀释为 IX模板5
各引物I. O 4. O pmol
各探针I. O 3. O pmol
Taq 酶0. 5 2. O U
dNTPI 2 mmol
MgCL22 3 mmol
甲酰胺I 2%
总体积25 μ 实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，I个循环；95°C变性25秒，64 °C退火20秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93 °C变性25秒，60 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准采用MX3000P实时荧光PCR仪进行扩增，在后31个循环退火阶段检测FAM和HEX的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性灵敏度分析取经定量后浓度为1000个拷贝的样品DNA，进行10倍稀释，然后分别对3个浓度进行检测，每次反应加入5μ L DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，10拷贝DNA基因组即可检出，结果如图2。重复性试验每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0. 5个循环。检测结果表明，本发明的检测体系可以准确检测质粒检测EML4-ALK融合突变，检测的灵敏度可达到5-10拷贝。实施例2运用本发明检测临床样本，取送我公司待检测的临床肺癌石蜡包埋组织样本110例，男性65例，女性45例，年龄为34-75岁，平均年龄为54岁，中位年龄50岁。利用本发明特异引物和探针荧光PCR体系检测110例临床样本的EML4-ALK的基因融合突变步骤如下(I)样本处理与RNA的提取
(a)取上述各肺癌样本，分别加入Iml 二甲苯，混匀，室温下14000RPM离心2min，弃上清液，加入Iml无水乙醇到沉淀中，震荡混匀(去除二甲苯)，室温下14000RPM离心2min弃上清液，打开离心管盖，37°C晾干；(b)在离心管中加150μ I Buffer PKD及10 μ I蛋白酶K，震荡混匀，56 °C孵育15min,8CTC孵育 15min,待降到室温后，加入 16ul DNase Booster Buffer 和 IOul DNaseI原液，室温孵育1511^11，后加入32(^1 Buffer RBC，混匀；(C)往上清液加入720 μ I无水乙醇，混勻，取700 μ I样品包括前面生成的沉淀转移到带有2ml收集管的RNA MinElute离心柱里,大于10，OOOrpm离心15s,弃废液,重复上一步直到样品转移到RNA MinElute离心柱里。(d)打开盖子加入500 μ I Buffer RPE,盖紧盖子，大于IOOOOrpm离心2min，将柱子转移到收集管中，向吸附膜中间部位滴加14-30 μ I RNase-free water,离心Imin后收集RNA.(2)建立PCR扩增反应体系将所提上述RNA溶于O. I % DEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度0D260/0D280为I. 9-2. 1，并读取其含量。取O. I 5 μ g的RNA作为其cDNA合成的模板，采用厦门艾德生物医药科技有限公司的试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系如下
5XM-MLV buffer 5μ 引物终浓度2 ρΜ
dNTPO. 5mM
M-MLV200U■
补DEPC水至25μ 应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录(a)取逆转录反应混合液18μ 1，M-MLV逆转录酶I μ 1，加入无菌离心管中，混匀。(b)加入待测样品RNA 6μ 1，RNA总量在O. I 5yg范围内，补水至25μ I。(c)42°C保温I个小时。(d) 950C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板.。将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR
扩增Takara IOXPCR Buffer 稀释为 IX模板5 μι
各引物I. O 4. O pmol
各探针I. O 3. O pmol
Taq 酶O. 5 2. O U
dNTPI 2 mmol
MgCL22 3 mmol
甲酰胺I 2%
总体积25 μL·实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，I个循环；95°C变性25秒，64 °C退火20
秒，72 °C延伸20秒，15个循环；93 °C变性25秒，60 V退火35秒，72 °C延伸20秒，31个循环。
后31个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准检测FAM荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果检测反应
体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标
准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性检测结果表明所检测110例肺癌样本中有8例发生有EML4-ALK融合突变，突变率
为7. 2%，同时对上述所有样本进行FISH对比检测，FISH结果表明突变有8例，两种检测方
法的符合率为100%，进一步证明了本发明体系检测的准确性，结果见表4。表2EML4-ALK基因9种融合突变
权利要求
1.用于检测EML4-ALK融合基因突变的引物、探针，其特征在于，包括以下序列SEQIDNO I-SEQ ID NO 24。
2.用于检测EML4-ALK融合基因突变的试剂盒，其特征在于，包括以下序列的引物和探针SEQ ID NO I-SEQ ID NO 24。
3.如权利要求2所述的用于检测EML4-ALK融合基因突变的检测试剂盒，其特征在于包括如下的荧光PCR的反应体系 模板5 μι 各引物I. O 4. O pmol 各探针I. O 3. O pmol Taq 酶O. 5 2. O U dNTPI 2 mmol MgCL22 3 mmol 甲酰胺I 2% 总体积20-40 μL
4.如权利要求3所述的检测EML4-ALK融合基因突变的检测试剂盒，其使用方法包括以下步骤 (I)提取检测样本中的RNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或胸腔液组织中的RNA ； ⑵RNA反转录cDNA，配制实时荧光PCR扩增反应体系； (3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性。
5.如权利要求4所述的检测EML4-ALK融合基因突变的检测试剂盒，其特征在于，mRNA反转录cDNA的反应体系为 5XM-MLV buffer 3~6μ引物终浓度1-3 PM dNTPl-2mM M-MLV100-300U。 RNA4~9μ 补 DEPC 水至20-40μ
6.如权利要求4所述的检测EML4-ALK融合基因突变的检测试剂盒，其特征在于，RNA反转录cDNA包括以下操作步骤 (a)取逆转录反应混合液18μ 1，M-MLV逆转录酶I μ 1，加入无菌离心管中，混匀。
(b)加入待测样品RNA6μ I, RNA总量在O. I 5yg范围内，补水至25 μ I。
(c)42 °C保温I个小时。(d) 95°C保温 5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板。
全文摘要
本发明公开了用于检测EML4-ALK融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒。本发明的引物和探针为SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 24。本发明的引物和探针可以特异检测EML4-ALK基因融合突变。本发明(1)建立了实时荧光PCR体系，可同时检测EML4-ALK基因9种融合突变；(2)灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；(3)操作简单，检测廉价，临床应用范围广；(4)样本检测范围广，样本可以为新鲜的病理组织，石蜡包埋组织或胸腔液；(5)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
文档编号C12Q1/68GK102719525SQ20121010678
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者周细武, 张海龙, 施伟杰, 罗捷敏, 郑立谋, 阮力 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司