专利名称：木霉菌产孢培养基及产孢方法
技术领域：
本发明涉及一种胡桃楸 内生真菌高效的产孢方法，特别是木霉菌产孢培养基及产孢方法。
背景技术：
该内生真菌是从胡桃楸树皮部分离得到的其发酵产物具有抗癌活性的菌株，进行初步鉴定该菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属。对该菌的发酵产物进行抗癌活性检测，其发酵产物能显著抑制肝癌细胞的生长，发酵液抗癌能力与lmg/L紫杉醇溶液基本相当。因此研究该木霉菌的分生孢子对其发酵产物抗癌活性和其机理的研究及其菌种的保藏具有重要的作用。目前，该木霉菌(木霉菌属长枝木霉(TrichoderimaIongibrachiatm)保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M208102 ;该菌株已经在中国专利CN101487022中公开。)为受专利保护的本实验室独有菌种，因此国内外尚无关于该种木霉菌产孢培养方法的报道，真菌通用的培养基不能很好的满足该菌的产孢要求，这极大地限制了对该种胡桃楸内生真菌以及其发酵产生的抗癌物质的进一步深入研究。
发明内容
本发明目的在于提供一种木霉菌的产孢培养基及产孢条件。本发明的胡桃球内生真菌木霉菌产孢培养基及产孢条件能很好的满足该菌种的产孢要求，培养五天产孢量可达到7. 4 X IO7个孢子/毫升培养基。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的本发明涉及一种木霉菌的产孢培养基，该培养基含有以下重量百分比的物质0. 5 5%果糖，0. 5 5%木糖以及90 99%的基本培养基。优选地，所述基本培养基含有以下重量百分比的物质0. 025 2. 5%酒石酸铵、0. 005 0. 5%酵母提取物、0. 005 0. 5%硝酸铵、0. 005 0. 5%磷酸二氢钾、0. 0025 0. 25%七水合硫酸镁、0. 0005 0. 05%氯化钠、0. 00065 0. 065% 二水合氯化钙、0. 01 I %七水合硫酸亚铁、0. 01205 I. 205%乙二胺四乙酸二钠、0. 04 4%琼脂，余量为水。本发明还涉及一种木霉菌的产孢方法，包括斜面菌种的制备，发酵种子的制备和产孢培养基配制及产孢工艺步骤，产孢培养基配制时，将前述的产孢培养基中含有的物质按重量百分比含量混合溶解后在100 140°C，高压灭菌20 60分钟；产孢工艺步骤为将前述的产孢培养基分装到250ml三角瓶中，每瓶10 25毫升，4°C保藏备用；吸取已保藏的孢子悬液或已培养好的该菌菌球置于产孢培养基中；产孢条件为温度22 28°C，每天光照时间0 15小时。本发明的有益效果在于I、本发明产孢培养基中各物质性能稳定，分别以果糖和木糖为碳源，以酒石酸铵和酵母提取物为氮源，提供了该菌产孢的碳元素和氮元素；加入的无机盐具有构成微生物细胞的组成成分，并且具有调节酶活性及细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位等功能；其中的磷酸氢盐调节培养基的酸碱度，维持该菌生长的最适PH值；满足了该菌的生长需要。2、本发明的产孢条件温和，容易控制。3、本发明的胡桃球内生真菌木霉菌产孢培养基培养五天产孢量可达到7. 4X107个孢子/毫升培养基。
图I为孢子数量与培养时间之间关系的曲线图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。以下实施例及对比例中选用的木霉菌为木霉菌属长枝木霉(TrichoderimaIongibrachiatm)，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M208102 ;该菌株已经在中国专利CN101487022中公开。对比例I真菌通用培养基-PDA培养基各原料含量关系如下
原料原料重量比百分率(％)
去皮土豆20
葡萄糖2
琼脂0.8产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120°C、高压灭囷40分钟，4 C保减备用；产孢条件200微升孢子悬液或直径约5毫米左右的菌球接种到含有20毫升固体培养基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。培养五天产孢量可达到
2.3 X IO6个孢子/毫升培养基。对比例2产孢培养基各原料含量关系如下原料原料重量比百分率(％)
葡萄糖3
酒石酸铵0. 5
酵母提取物0. I
硝酸铵0. I
磷酸二氢钾0. I
七水合硫酸镁0. 05
氯化钠0.01
二水合氯化钙0. 013
七水合硫酸亚铁0. 2
乙二胺四乙酸二钠0.241
琼脂0.8
水94.886产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120°C、高压灭囷40分钟，4 C保减备用；产孢条件200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升固体培养基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。培养五天产孢量可达到1.4X105个孢子/毫升培养基。实施例I—种木霉菌产孢培养基各原料含量关系如下
原料原料重量比百分率(％)
果糖1.5木糖I. 5
酒石酸铵0. 5
酵母提取物0. I
硝酸铵0. I
磷酸二氢钾0. I
七水合硫酸镁0. 05
氯化钠0.01
二水合氯化钙0. 013
七水合硫酸亚铁0. 2
乙二胺四乙酸二钠0.241
琼脂0.8
水94.886产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120°C、高压灭囷40分钟，4 C保减备用；产孢条件200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升产孢培养基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。该木霉菌的孢子数量与培养时间之间关系的曲线图如图I所示，由图I可知培养五天产孢量可达到7. 4X107个孢子/毫
升培养基。由实施例I与对比例2的比较可知，实施例I的采用果糖和木糖作为碳源的产孢培养基，培养五天产孢量可达到7. 4 X IO7个孢子/毫升培养基，其效果远高于对比例2的 采用葡萄糖作为碳源的产孢培养基(培养五天产孢量为I. 4X IO5个孢子/毫升培养基)。由实施例I与对比例I的比较可知，本发明的产孢培养基的产孢效果高于真菌通用培养基-PDA培养基的产孢效果(培养五天产孢量为2. 3 X IO6个孢子/毫升培养基)。实施例2产孢培养基各原料含量关系如下
原料原料重量比百分率(％)
果糖0.5
木糖0. 5
酒石酸铵0. 025
酵母提取物0. 005 硝酸铵0.005
磷酸二氢钾0. 005
七水合硫酸镁0. 0025
氯化钠0.0005
二水合氯化钙0. 00065
七水合硫酸亚铁0. 01
乙二胺四乙酸二钠0.01205
琼脂0.04
水98.8943产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在100°C、高压灭囷60分钟，4 C保减备用；产孢条件200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升固体培养基的三角瓶中，22°C，培养5天。培养五天产孢量可达到I. 2 X IO7个孢子/毫升培养基。实施例3 产孢培养基各原料含量关系如下
原料原料重量比百分率(％)
果糖5.0
木糖5.0
酒石酸铵2. 5
酵母提取物0. 5
硝酸铵0. 5
磷酸二氢钾0. 5
七水合硫酸镁0. 25
氯化钠0.05
二水合氯化钙0. 065
七水合硫酸亚铁I. 0
乙二胺四乙酸二钠1.205
琼脂4
水79.43产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在140°C、高压灭囷20分钟，4 C保减备用；
产孢条件200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的木霉菌菌球接种到含有20毫 升固体培养基的三角瓶中，28°C，每天光照时间15小时，培养5天。培养五天产孢量可达到5. 2 X IO6个孢子/毫升培养基。
权利要求
1.一种木霉菌的产孢培养基，其特征在于，该培养基含有以下重量百分比的物质O.5 5%果糖，O. 5 5%木糖以及90 99%的基本培养基。
2.根据权利要求I所述的木霉菌的产孢培养基，其特征在于，所述基本培养基含有以下重量百分比的物质0. 025 2. 5 %酒石酸铵、O. 005 O. 5 %酵母提取物、O. 005 O. 5%硝酸铵、O. 005 O. 5%磷酸二氢钾、O. 0025 O. 25%七水合硫酸镁、O. 0005 O. 05%氯化钠、O. 00065 O. 065 %二水合氯化钙、O. 01 I %七水合硫酸亚铁、O. 01205 I. 205 %乙二胺四乙酸二钠、O. 04 4%琼脂，余量为水。
3.—种木霉菌的产孢方法，包括斜面菌种的制备，发酵种子的制备和产孢培养基配制及产孢工艺步骤，其特征在于，产孢培养基配制时，将权利要求I所述的产孢培养基中含有的物质按重量百分比含量混合溶解后在100 140°C、高压灭菌20 60分钟，保藏备用 ’产孢工艺步骤为吸取已保藏的孢子悬液或已培养好的木霉菌菌球置于所述产孢培养基中，其中产孢条件为温度22 28°C，每天光照时间O 15小时。
全文摘要
本发明公开了一种木霉菌产孢培养基及产孢方法。该木霉菌产孢培养基由果糖、木糖和一种基本培养基(酵母提取物、酒石酸铵、硝酸铵、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氯化钠、二水合氯化钙、七水合硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠和水)组成。分别以果糖和木糖为碳源，以酒石酸铵和酵母提取物为氮源；加入的无机盐具有构成微生物细胞的组成成分，并具有调节酶活性及细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位等功能；其中的磷酸氢盐调节培养基的酸碱度，维持该菌生长的最适pH值；满足了该菌的生长需要。本发明的产孢方法为22～28℃，光照培养。本发明的胡桃球内生真菌木霉菌产孢培养基培养五天产孢量可达到7.4×107个孢子/毫升培养基。
文档编号C12N3/00GK102660493SQ20121010670
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者张星星, 苗志奇, 陈榕华 申请人:上海交通大学