专利名称：一种表达人抗体全基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体及其方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域。本发明涉及利用重组腺相关病毒(rAAV)载体高效表达人抗体全基因的技术平台。在具体应用中将不限于本研究中所使用的载体及抗体基因。
背景技术：
抗体(Antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，抗体具有特异性强、副作用小、免疫原性低、生物活性单一等特点，由于其独有的特征已迅速应用于生物 学和医学的很多领域。目前世界上有30多个抗体药物已经获得批准上市，主要集中在肿瘤、自身免疫性疾病和感染类疾病等方面。目前应用的抗体药物的种类主要有鼠源性抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体，鼠源性抗体由于能够诱发人体产生人抗鼠抗体、半衰期短，引起过敏反应和超敏反应等缺点，影响其在肿瘤、器官移植等疾病和的诊断和治疗上的应用。人-鼠嵌合抗体和人源化抗体由于与抗原的结合能力弱，长时间使用能诱发人体产生人抗鼠抗体也是其应用受到限制，而人抗体具有更低的免疫原性、更好的安全性、更慢的清除周期，目前抗体药物的发展主要方向是向全人抗体发展，有的抗体在临床治疗比较成功，但对于抗体的广泛应用还是受到生产能力的限制，提高抗体全基因的表达效率，包括在体内的基因治疗和体外哺乳细胞的大量表达等方面都将产生重要的意义。当前，我国表达载体和细胞株改造都远远落后于欧美国家，所以治疗性抗体药物重点解决的问题之一是建立高效表达抗体基因的载体。抗体的基本结构相似，都是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)通过二硫键连接而成，将重链和轻链构建在载体上进行高效的表达是关键所在，这样就涉及到双基因共表达的构建策略。双基因共表达的构建策略主要有以下几个方面(I)双启动子的构建策略，这种策略是用双表达盒表达两个基因，用各自独立的启动子转录不同的基因，启动子可以一样也可以不一样，载体上有两个启动子和两个PolyA。这种构建策略的缺点是内部启动子占用了载体上有限的克隆空间，为了增加克隆空间可以用两个启动子和一个PolyA的构建方案，这两种方案在不同的载体中转录效果也不尽相同。真核载体常用的启动子有CMV、EF-la、hPGK、CAG、mPGK等，不同启动子有不同的转录效率，同时在不同组织中转录的效率也不尽相同；(2)引入IRES的构建策略，两个基因之间插入内核糖体插入位点(internal ribosomal entry site, IRES)序列使其为同一启动子驱动而转录为单个mRNA,但翻译为两种不同的蛋白质。这种构建方案能够避免双启动子转录时的相互干扰，但置于IRES下游基因表达量远远比上游基因表达量的效率低很多；(3)融合表达的构建策略，用连接肽(linker)将两个基因相连，在一个启动子调控下翻译出具双功能的融合蛋白分子，但对于抗体来说需要轻、重链分别表达才能组装成功能和立体结构完整的IgG。除此之外还有供体/受体位点剪切构建策略、Furin切割构建策略、2A序列自我切割构建策略等，这些构建策略由于在体内切割效率低，两基因的表达效率也很不稳定，还有部分剪切的调节机制还都不清楚。
腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型病毒,是一种安全有效的基因转移载体,在正常细胞中并不发生产毒性感染，其载体中不含任何AAV的结构基因，载体基因组中含有的唯一病毒序列是非编码的反向末端重复序列(ITR)，因而转导后不合成天然的病毒蛋白，目前rAAV2已用于多种人类疾病的基因治疗研究。现在各种血清型AAV载体都是在2型AAV(AAV2)基础上改造的“杂合”载体，即使用AAV2的ITRs以及全部或部分AAV2的R印基因，换上其他血清型AAV的Cap蛋白。AAV2/1载体具有AAV2的ITR和AAVl的外壳，其具有野生型AAVl病毒的细胞亲嗜性、感染特性。实验结果表明，AAV2/1载体转导骨骼肌的效率明显高于AAV2载体，外源基因的表达水平高10倍以上，表达时间也明显提前。将AAV2/1载体进行肌肉注射后，实验中可以明确地观察到目的基因的表达范围比AAV2更宽，甚至扩散到整块肌肉。AAV作为载体具有安全性好、宿主范围广、物理性质稳定、易于运输和保存、可长期稳定地表达外源基因等这些特点，使用重组AAV载体表达抗体全基因用于基因治疗和疫苗研究等方面具有很好的前景。在抗体药物治疗和应用中，很重要的一点是要提高抗体的表达量，同时也要避免启动子相互干扰，以免造成不同基因表达水平的不一致。抗体全基因的表达，由于轻链表达量大于重链表达量才能更好更多的组装成完整的抗体，所以应该尝试多种双基因载体构建的方案，而且不同的构建方案在不同的载体在表达抗体时，其表达效率不尽相同。基于以上理论，为建立AAV载体高效表达抗体全基因技术平台。我们采用了多种双基因表达策略并获得一种高效表达抗体全基因的最佳方案。
发明内容
本发明目的是提供利用AAV载体系统构建包含人抗体重链和轻链全基因的高效双基因表达系统。本发明以HIV人中和抗体2G12全基因为模型，利用AAV2/1穿梭表达载体pSNAV(AAV2/l的包装和pSNAV载体来源于本元正阳基因技术有限公司，参见附图I)(伍志坚，吴小兵等.一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统.中国科学C辑，2001，31(5)423-430)构建高效表达人抗体全基因的AAV载体表达系统。研究思路是通过多种双基因表达的构建策略(参见附图3)，在细胞水平上比较表达2G12的效果(参见附图4)，在此过程中构建了 pSNAV/eLcH载体(参见附图2)，转染此载体于BHK 21细胞，建立了稳定表达2G12的细胞株BHK21/2G12。本专利对此表达系统在SCID小鼠体内进行了免疫验证，结果证明此系统不仅在细胞水平有很好表达抗体的效果，同时在哺乳动物体内也能够长期高效的表达(参见附图5)。本发明为AAV载体表达抗体全基因在抗体治疗、高产细胞株等方面提供了一个很好的平台。此发明在载体构建时，在载体的多克隆位点引入便于各种抗体轻重链基因插入的酶切位点，载体的多 克隆位点插入的酶切位点及其顺序为EcoR I-Not I--Sfi I，因为这三个酶切位点是人基因中比较稀有的酶切位点，在表达其它的人抗体基因时就不需为加入新酶切位点而改造载体。此外利用Sfi I内切酶识别序列的特殊性，在重链两端都是SfiI，仅用Sfi I酶单切就可以将其构建在载体上，而且不改变其方向。(参见附图3)此发明建立了双抗体ELISA法定量测定人IgG含量的方法，该方法简单，重复性好，特异性强，背景低，可直接定量测定血清及纯化样品等各种培养物中人抗体的含量。
图I为表达载体pSNAV质粒图谱图2为表达最佳的载体pSNAV/ELCH质粒图谱图3为pSNAV载体采用14种不同方案表达2G12轻、重链的构建示意4为pSNAV/2G12采用14种双基因构建方案的表达量的比较5为AAV-2G12在SCID小鼠体内不同时间的平均表达量
具体实施方案实施例I :pSNAV表达2G12各种表达方案的构建步骤I. pSNAV表达2G12质粒的构建步骤(I)去除AAV穿梭表达载体pSNAV中的酶切位点Sfi I Sfi I酶切载体pSNAV，用T4 DNA polymerase将粘末端酶切位点平滑化，再用T4 DNA Iigase连接为无Sfi I酶切位点的pSNAV。(2)在载体pSNAV的多克隆位点插入linker :为便于将IgG的轻链(L)和重链⑶插入载体，设计含有EcoR I-Not I-Sfi I的linker39，其两端拥有EcoR I和Bgl II酶切位点的粘末端，与载体pSNAV相连接为pSNAV/linker39。linker39设计的引物如下:Linker 39F 5 '…aattcataagaatgcggccgctataggccaactaggcca…3 ' (SEQ IDNO. I)Linker 39R 5 '…gatctggcctagttggcctatagcggccgcattcttatg…3 ' (SEQ IDNO. 2)(3)2G12轻链中EcoR I酶切位点的突变及扩增。2G12轻链长712bp，EcoR I酶切位点是gaattc，在不改变氨基酸的基础上将轻链中gaa改为gag，使EcoR I不能识别。引物如下2G12_Lc F :5'…cgcgaattccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ ID NO. 3)EcoRI R:5'…ctgatggtgagagtgaactctgtcccagatccac…3' (SEQ ID NO. 4)EcoRI F :5'…gtggatctgggacagagttcactctcaccatcag…3' (SEQ ID NO. 5)2G12_Lc R:5'…gaatgcggccgcctaacactctcccctgttg... 3' (SEQ ID NO. 6)⑷2G12轻链加Poly A的扩增和EcoR I酶切位点的突变2G12-Lc/pA连接在一起共长880bp，同时将轻链上EcoR I酶切位点突变，识别序列是gaattc，在不改变氨基酸的基础上将轻链中gaa改为gag，使EcoR I不能识别。2G12_Lc/pA F :5'…cgcgaattccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ ID NO. 7)EcoRI R:5'…ctgatggtgagagtgaactctgtcccagatccac…3' (SEQ ID NO. 4)EcoRI F :5'…gtggatctgggacagagttcactctcaccatcag…3' (SEQ ID NO. 5)2G12_Lc/pA R:5'…gaatgcggccgcgatccagacatgataagatac…3' (SEQ ID NO. 8)(5)PO^j^|2G12-H(Sfi I, Sfi I)、IRES (Not I, Sfi I)、hPGK(Not I, Sfi I)、CMV(Not I, Sfi I)和 EF-I a (Not I, Sfi I)。引物如下IRES (Not I, Sfi I)
IRES F :5'…tagcggccgcacgcgtcgagcatgcatctag…3' (SEQ ID NO. 9)IRES R :5'…taggcctacaaggcccgggttgtggcaagcttatcatc…3' (SEQ ID NO. 10)H(Sfi I, Sfi I)2G12_Hc F :5'…taggccttgtaggcctccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ ID NO. 11)2G12_Hc R 5 '…atggcctagttggcctcatttacccggagacagggagag…3 ' (SEQ IDNO. 12)
CMV(Not I, Sfi I)CMVl F :5'…tagcggccgcttcgagctcgcccgacattg... 3' (SEQ ID NO. 13)CMVl R 5 '…taggcctacaaggccgatctgacggttcactaaac gagctc…3' (SEQ IDNO. 14)EF-I a (Not I, Sfi I)EF-Ia Notl :5'…tatagcggccgcggctccggtgcccgtcagtg... 3' (SEQ ID NO. 15)EF-Ia SfilA2 5 '…gcggcctacaaggcctcacgacacctgaaatggaag…3 ' (SEQ IDNO. 16)hPGK(Not I, Sfi I)h PGK Notl :5'…tatagcggccgcggggttggggttgcgccttttc…3' (SEQ ID NO. 17)h PGK SfilA 5;…atggcctacaaggccctggggagagaggtcggtgattc…3 ' (SEQ IDNO. 18)(6)通过酶切位点EcoR I和Not I将2G12的L和LA插入载体pSNAV/linker39构建为 2G12-pSNAV/L、2G12-pSNAV/LA。(J)通过酶切位点 Not I 和 Sfi I 将 IRES、CMV、hPGK、EF-Ia 和 2G12 的 H 分别共同连接到 2G12-pSNAV/L，构建为 pSNAV/cLIH、pSNAV/cLcH、pSNAV/cLeH、pSNAV/cLhH ;通过酶切位点Not I和Sfi I将CMV、hPGK、EF-la和2G12的H分别共同连接到2G12_pSNAV/LA，构建为 pSNAV/cLAcH、pSNAV/cLAeH、pSNAV/cLAhH。2. 2G12轻、重链互换位置方案的构建步骤(l)PCI^；^|2G12-H(EcoR I, Not I)、2G12_L(Sfi I, Sfi I)为便于使用载体上引入的多克隆位点EcoR I,Not I和Sfi I，必须重新换合适的酶切位点，即 2G12-H(EcoR I, Not I)、2G12_L(Sfi I，Sfi I)，PCR 扩增引物如下:2G12-H(EcoR I. Not I)2G12_H_EcoRI :5'…cgcgaattccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ ID NO. 19)2G12-H_Not 1:5'…aatgcggccgctcatttacccggagacagg...3' (SEQ ID NO. 20)2G12-L(Sfi I, Sfi I)2G12-L~Sfi I A :5'…attggccttgtaggccttccaccatgggatggtcatg…3' (SEQ IDNO. 21)2G12-L~Sfi IB :5'…atggcctagttggccctaacactctcccctgttgaag…3' (SEQ IDNO. 22)(2)通过酶切位点EcoR I和Not I将2G12的H载体pSNAV/linker39构建为2G12-pSNAV/H(3)通过酶切位点Not I和Sfi I将CMV、hPGK、EF_la和2G12的L分别共同连接到 2G12-pSNAV/H，构建为 pSNAV/cHhL、pSNAV/cHcL pSNAV/cHeL。3. pSNAV载体换启动子方案的构建步骤(I) linker23的设计和连接为便于将载体pSNAV的CMV启动子替换为EF-Ia启动子，需要设计一段linker，插入linker的酶切位点包括Xho I、Xbal I和EcoR I。设计含有这三个酶切位点的linker23，其两端拥有Xho I和EcoR I酶切位点的粘末端，与载体pSNAV相连接为pSNAV/linker23。Linker23设计的引物如下:Linker23F 5;…tcgaggctctagagcggtaccgg…3' (SEQ ID NO. 23)Linker 23R:5'…aattccggtaccgctctagagcc…3' (SEQ ID NO. 24)(2)PCR扩增EF-I a，在其两端引入酶切位点Xba I和EcoRI，设计的引物如下EFla Xbal 1:5'…attctagaggctccggtgcccgtcagtg…3' (SEQ ID NO. 25)EFla EcoRI 1:5 ' ... gccgaattctattagtaccaagctaattcctcacg…3 ' (SEQ IDNO. 26)(3)通过酶切位点Xba I和EcoRI将EF-1 a插入载体pSNAV/linker23构建为pSNAV/EF-1a 。(4)通过酶切位点 Xba I 和 RsrI 将 pSNAV/cLcH、pSNAV/cLAcH、pSNAV/cLeH 和pSNAV/cLAeH 酶切后分别连接 pSNAV/linker23 构建为 pSNAV/eLcH、pSNAV/eLAcH、pSNAV/eLeH、pSNAV/eLAeH。实施例2 :双抗体夹心ELISA法定量测定人IgG含量的方法(I)包被包被 Goat anti human kappa, UNLB (公司Southern Biotech,货号2070-01)，50ng/孔，4°C包被过夜，PBST洗三遍，不包被右下角2x2空白对照孔。(2)封闭用5%的脱脂奶粉封闭，100 U I/孔，37°C封闭I小时，PBST洗三遍。(3)加标准品和待测样品在同一酶标板上加入IgG 标准品(Invitrogen，lot 1069920A, TEF 027102)和待测样品，标准品从第一孔以0. I u g/ml开始连续8个稀释度进行倍比稀释，做两个复孔；待测样品(包括细胞表达上清、小鼠血清等)以一定稀释度连续8个稀释孔进行倍比稀释，做两个复孔，37°C孵育I小时，PBST洗三遍。(4)加酶标抗体将 I : 75OO 稀释的 Peroxidase-Conjugated Goat Anti-HumanIgG(H+L)(生产厂家北京中杉金桥生物技术有限公司)加入每个反应孔中，IOOiU/孔，37°C孵育I小时，PBST洗五遍。(5)显色每孔加入临时配制的TMB底物溶液(北京万泰生物药业股份有限公司)100 ill，室温避光反应10分钟左右。(6)终止反应每孔中加入2M硫酸50 U I终止反应。(7)结果检测用酶标仪在450nm测定吸收值。(8)人IgG定量以标准品及对应的OD值做散点图，据校准曲线计算出待测样品的IgG含量。实施例3 2G12采用14种双基因构建方案在细胞水平上的表达将提取的高纯度的14种构建方案的质粒(pSNAV/cLIH、pSNAV/cLcH、pSNAV/cLeH、pSNAV/cLhH、pSNAV/cLAcH、pSNAV/cLAeH、pSNAV/cLAhH、pSNAV/cHhL、pSNAV/cHcLpSNAV/、cHeL、pSNAV/eLcH、pSNAV/eLeH、pSNAV/eLAcH、pSNAV/eLAeH)瞬时转染 293T 细胞，用 FuGENEHD转染试剂(罗氏，Cat. No. 04709705001)转染，具体操作按FuGENE HD说明书进行，通过双抗体夹心ELISA法测定人IgG含量方法(方法见实施例2)检测转染72小时细胞上清的人IgG含量。结果如表I中所示，通过比较这14种构建方案的表达，获得pSNAV/eLcH是高效表达人抗体全基因的最佳方案。表I
构建方案~PTeLcH~~P/cLcH ~P/cLeH P/eLeH ~P/cLAcH ~P/eLAcH ~P/eLAeH 表达量(U g/ml) 39. 28 38. 78 25. 19 22. 21 21. 37 21. 08 19. 51构建方案P/cLAeH P/cLhH P/cHcL P/cLAeH p/LIH P/cHhL P/cHeL~
表达量(y g/ml) 15.02 10. 19 O TlL3L3I实施例4 :稳定表达2G12细胞株BHK21的筛选筛选采用G418压力选择和有限稀释法克隆化，具体方法如下a.将瞬时表达检测的BHK细胞用胰酶消化，做细胞计数，按照每孔细胞数为32、16、8、4、2、1个细胞方式铺4个96孔板，每孔IOOii I 10% Iow-IgG FBS，用加入抗生素G418(800 u g/ml)进行筛选。b.生长8-10天，ELISA检测单个细胞孔中上清IgG含量，选择高表达孔细胞继续传代，G418保持浓度是100 u g/ml。c.传至6孔板继续检测细胞表达上清IgG含量。d.传至T25瓶中检测细胞表达上清IgG含量，选择几株持续高表达细胞冻存。实施例5 AAV-2G12在SCID小鼠体内表达的实验I.疫苗免疫和分组12只8周龄SCID雌性小鼠随机分成2组，第I组PBS对照组，3只，与实验组相同的免疫时间点，肌肉注射200 u I无菌PBS ;第2组rAAV2/l空病毒对照组，3只，与实验组相同的免疫时间点，肌肉注射200 ill rAAV2/l空病毒；第3组:AAV_2G12病毒免疫组，6只，于实验开始的0周肌肉注射200 u I纯化的AAV-2G12病毒载体，所用AAV剂量为2 X IO1Vg/只。2.双抗体ELISA法测定SCID小鼠血清中人IgG量及其中和活性方法见实施例2 :双抗体ELISA法定量测定人IgG含量的方法。AAV-2G12注射2周就可以检测到抗体2G12的表达，2G12在体内的表达一直在增力口，到48周时仍在高效的表达，而且表达越来越高。(结果参见表二、图5)将SCID小鼠血清中的IgG进行纯化，纯化后IgG对HIV-I假病毒有较好的中和活性，SCID小鼠血清的中和实验结果证明2G12-AAV/eLcH在动物体内不仅能够高效长期的表达2G12，而且表达的2G12具有中和活性，说明本发明建立了 AAV表达人抗体全基因的技术
Tno表二
权利要求
1.一种表达人抗体全基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体，其特征在于，利用AAV2/1穿梭表达载体PSNAV构建而成。
2.如权利要求I所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体，其特征在于该载体的ITR之间的序列为5 ‘-ITR-promoterl-murine IgGl signal peptide-L chain-promoter2_murineIgGl signal peptide-H chain_SV40 polyA-ITR。
3.如权利要求1、2所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体，其特征在于在pSNAV的基础上具有 5 ‘-ITR-promoterl -murine IgGl signal peptide-L chain-promoter2_murineIgGl signal peptide-H chain_SV40 polyA-ITR-Ampicillin resistance-ColE ori_SV40启动子-neo-SV40 Ploy A的基因结构单元。
4.如权利要求2或3所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体，其特征在于所述的promoter I 为hEF_l a promoter ;所述的 promoter2 为 hCMV IE promoter。
5.如权利要求1-4所述的重组腺相关病毒(rAAV)载体，其特征在于，该载体为pSNAV/eLcH，所表达的抗体为HIV人中和抗体2G12全基因。
6.—种构建表达人抗体全基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，其具体构建方法为 1)通过PCR的方法改造pSNAV载体，并在载体pSNAV的多克隆位点插入linker； 2)利用PCR 技术扩增出 hEF-1 a promoter、murine IgGl signal peptide、目的抗体的轻链、hCMV IE promoter、murine IgGl signal peptide、目的蛋白的重链、SV40 polyA等基因结构单兀； 3)利用酶切位点将步骤2)中各结构单元顺次连接，克隆到改造好的pSNAV 载体的多克隆位点中，形成 5 ‘-ITR-promoterl-murine IgGl signalpeptide-Lchain-promoter2-murine IgGl signal peptide-H chain_SV40 polyA-ITR 的基因结构单元； 4)即得到重组腺相关病毒(rAAV)载体。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于步骤4)中所述的载体为权利要求5所述的pSNAV/eLcHo
全文摘要
本发明涉及分子药物和基因治疗领域，具体而言，利用AAV2/1穿梭表达载体pSNAV构建高效表达人抗体全基因的AAV载体表达系统。该表达系统不仅在细胞水平有很好表达抗体的效果，同时在哺乳动物体内也能够长期高效的表达，本发明为AAV载体表达抗体全基因在抗体治疗、高产细胞株等方面提供了一个很好的平台。
文档编号C12N15/864GK102634542SQ20121010694
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者余双庆, 冯霞, 周玉柏, 曾毅, 管永军, 贾润清 申请人:北京工业大学, 曾毅, 管永军, 贾润清