一种在哺乳动物细胞中生产dha的方法

专利名称：一种在哺乳动物细胞中生产dha的方法
技术领域：
本发明涉及w-3多不饱和脂肪酸DHA在哺乳动物细胞中的生物合成方法。
背景技术：
多不饱和脂肪酸(PUFAs)是ー类被广泛研究和关注的脂肪酸。PUFAs主要包括Co-6和《-3PUFAS两种类型，每ー种类型都包括多个从短碳链(18C)到长碳链(22C)的、且含有多个不饱和键的脂肪酸。越来越多的研究证明，PUFAs具有广泛的生物学功能，它们參与细胞膜的构成并作为许多细胞应答过程中的信号分子，与人类的多种疾病的发生紧密相关，其适宜的含量对于人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要。
-6PUFAs从总体上来说对人体意义不大，其过量的摄入反而危害人体健康。《 -3PUFAs已经被证实在预防和治疗心血管疾病、关节炎、癌症等多种疾病方面有着重要作用。其中特别是二十ニ碳六烯酸(docosahexaenoic acid ；DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid, EPA),对人体健康具有重要的积极意义。DHA可促进脑、视网膜形成和延缓脑的衰老。英国脑营养化学研究所的Michael教授在首届国际DHA学术讨论会上提出“DHA不仅可以促进人脑活动，还使头脑聪明”。后来的研究证实=DHA是人脑的主要组成物质之一，约占人脑脂肪的10%左右。主要以磷脂的形式存在于中枢神经系统细胞如大脑突触体细胞和视网膜细胞如视网膜光感受器细胞的膜磷酯酰こ醇胺中。动物实验则从反面证实，若神经系统和视网膜中DHA积累不足，可以导致视网膜电流图波形改变及视觉灵敏度下降。G. J. An-derson研究了 EPA对小鸡脑发育的影响。他发现，EPA能迅速在脑中合成DHA并蓄积，这说明DHA是真正对脑的发育起重要作用的物质。因此，在脑的早期形成过程中，适时、适量、持续补充人体必需的多不饱和脂肪酸是重要的和必要的。DHA对维持脑的功能、延缓脑的衰老也起重要作用。如果缺乏DHA，已形成的脑的突起会逐渐萎縮，脑细胞间的信息传递能力就会下降，同时还会使感观功能衰退。日本研究证实，DHA在一定程度上可以提高脑的柔软性，抑制脑的老化，有益健脑。DHA能改善心脑血管功能和大脑供能状況，使大脑的自我营养体系得到完善，因而对因年龄等萎縮死亡的脑细胞起明显的修复作用。所以，给大脑补充DHA在一定程度上能达到预防、治疗老年性痴呆的目的。DHA可起到降血脂、预防和治疗动脉粥样硬化的功能。动脉粥样硬化(AS)是中老年人的常见病和多发病，也是世界上死亡率最高的疾病之一。高血脂是致病的重要因素。大量的实验表明富含EPA和DHA的鱼油能有效地降低血液中的中性脂质、总胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和升高高密度脂蛋白。DHA降胆固醇的作用较EPA強。DHA可抑制肿瘤生长。流行病学调查发现，以海产物为主食的爱斯基摩妇女，因患 乳腺癌而死亡的人非常少。成泽富雄报道鱼油中DHA和EPA均具有抑制直肠癌的作用，而且DHA的抑制效果更強。Dustin等发现DHA能抑制巨噬细胞的激活及具有杀伤肿瘤细胞的活性。DHA还可降低治疗胃癌、膀胱癌、子宮癌等抗肿瘤药物的耐药性，并且高纯度DHA可抑制大肠粘膜上产生异常腺窝及抑制异常腺窝的生长。在浓度为2. 0mg/ml吋，DHA和EPA都能使PC-3细胞生长减少65%。DHA可起到抗炎、抑制过敏反应的作用。爱斯基摩人患喘息性气管炎、风湿性关节炎、红斑狼疮等以自身免疫异常为原因的慢性炎症性疾病的发病率明显低于当地的白种人。大量从海鱼、海兽中摄取DHA、EPA无疑是ー个重要的原因。同时实验发现，饲喂EPA的动物，其实验性炎症的水肿程度降低。DHA和EPA在陆地动物中含量甚微或根本没有。但在高等动物的脑组织、眼角膜、肇丸及精液中，都含有较高的DHA。DHA属于《3系列长碳链多不饱和脂肪酸，它们和《6系列的脂肪酸在动物体内是不能相互转化的。在人体中，能将从植物中摄取的a-亚麻酸微量地转化为EPA和DHA，能满足一般人的健康需要。但是老年人、幼儿及糖尿病人则不能将a -亚麻酸有效地转化为EPA和DHA。这些 人需要从食物中直接摄取EPA和DHA。由于哺乳动物及人类自身都不能合成的《_3PUFAs (也不能合成《-6PUFAs)，因此人体对它们的需要必须依靠从食物来源获取。由于自然界《-6PUFAs丰富而《-3PUFAs极少，从而使人体中《-6PUFAs的摄入过多而《_3PUFAs仍然严重不足，人体中《-6/ -3的比率高达16以上。因此，人体増加其摄入量成为合理利用脂肪酸的关键。由于DHA对维持健康的重要性，以及良好的疗效和很小的副作用等优点，使它ー跃而成为ー种新型的营养品、保健品和疗效食品。广泛被用于保健胶囊、食品、饲料等产品中。日本已把高含量DHA鱼油确定为21世纪的智能食品加以开发应用。我国自“九五”规划起也把DHA/EPA作为“海洋蓝色工程”的重要项目之一来进行实施开发。我国卫生部也批准了不少鱼油EPA、DHA方面的保健食品。如何获取到丰富的DHA是当今世界范围内人们所关心的ー个问题。目前的主要来源是海产鱼油。鱼油中DHA和EPA的含量并不稳定，受鱼的品种、季节及产地的影响。鱼油中二者的含量在4% 40%之间，由于所用的原材料大都很贵，产品价格昂贵。另外鱼油有鱼腥味，使得应用受到一定的限制，重金属汞污染也是ー个限制应用因素。另外一条途径是利用真菌和藻类生物合成DHA，可克服鱼油资源的限制，产品也没有腥臭味。研究表明，ー些微生物具有合成EPA、DHA的能力。主要有真菌和藻类。水霉目的破囊壶菌Thraustochytrium和裂埴壶菌Schizochytri-um能产生有意义含量的DHA,金藻中的DHA含量约为10%;甲藻也含有高含量的DHA。随着一系列《3脂肪酸去饱和酶基因的发现和功能验证，通过基因工程技术来生产《-3PUFAs已经逐步成为科学家们所努力的方向。《_3脂肪酸去饱和酶基因是 -3PUFAs合成的关键基因，它们利用《-6PUFAs为底物在脂肪酸碳链甲基端第三个碳催化生成ー个不饱和键(烯键)而合成相应的《-3PUFAs。近年来，各国的科学家克隆了多个《_3脂肪酸去饱和酶基因，但其中大部分基因只能合成18C的《-3PUFAs，开发利用价值不大。虽然也有报道能够合成更长链的《_3PUFAs基因，如真菌Saprolegnia diclina的w_3脂肪酸去饱和酶能够合成20C的co_3PUFAs,另一种真菌Mortierella alpina 1S-4不但能够合成20C的《-3PUFAs，还能合成18C的《_3PUFAs。但直到目前尚未见这些基因被用于基因工程技术以及转基因动物手段来生产《_3PUFAs。真正被用于此类研究的基因是来自于线虫C. elegans的《 _3脂肪酸去饱和酶基因fat_l。该基因被转入哺乳动物细胞以及小鼠中能使从18C到22C的《-3PUFAs的含量増加，显示出来很大的可开发利用价值。但美中不足的是所合成的《_3PUFAs中价值更大的22C的DHA的水平仍然很低。
自1978年Dyerberg发表有关爱斯基摩人的流行病学调查以来，对EPA和DHA的生理和药理作用的研究已取得显著成就，研究范围从原来的基础研究，药理和临床研究，逐步扩大到作为医药品、高级营养品的应用研究。由于EPA和DHA是理想的疗效食品或营养品，极少的毒副作用，可以期待在我国也为大众所接受和欢迎。所以，培养富含EPA和DHA的陆生哺乳动物如猪等，必将有ー个光明的前途。

发明内容
本发明的目的是ー种在哺乳动物细胞中生产DHA的方法及其专用试剂盒本发明所提供的在哺乳动物细胞中生产DHA的试剂盒，包括《_3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因和哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因。所述《-3脂肪酸去饱和酶基因为线虫(Caenorhabditis briggssae)的《_3脂肪酸去饱和酶基因，优选为sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列为序列表中序列I ;所述哺乳动物脂肪酸延长酶基因为小鼠脂肪酸延长酶基因，优选为小鼠elovl2基因，所述 小鼠elovl2基因的核苷酸序列为序列表中序列2;所述哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因为小鼠脂肪酸去饱和酶基因，优选为小鼠A6desaturase基因，所述小鼠A 6desaturase基因的核苷酸序列为序列表中序列3。所述试剂盒中还包括真核表达载体，所述真核表达载体为pCAGGS，真核表达载体pCAGGS购自Addgene，其序列已经由该公司公布；所述试剂盒还包括抗性筛选标记基因；所述抗性筛选标记基因包括zeocin抗性基因、neomycin抗性基因和hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，优选为序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸！neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，优选序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，优选自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。本发明还提供一种制备DHA生产能力提高的哺乳动物转基因细胞系的方法。所述制备DHA生产能力提高的哺乳动物转基因细胞系的方法是利用上述试剂盒制备哺乳动物转基因细胞系，具体是将《_3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因、哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因导入哺乳动物细胞中，筛选获得稳定整合及表达《_3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因、哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因的哺乳动物转基因细胞系。所述《-3脂肪酸去饱和酶基因为线虫(Caenorhabditis briggssae)的《_3脂肪酸去饱和酶基因，优选为sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列为序列表中序列I ;所述哺乳动物脂肪酸延长酶基因为鼠脂肪酸延长酶基因，优选为小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列为序列表中序列2 ;所述哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因为鼠脂肪酸去饱和酶基因，优选为小鼠A 6desaturase基因，所述小鼠A6desaturase基因的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述哺乳动物细胞为鼠细胞，优选为中国仓鼠卵巢细胞Kl(CH0-K1)。所述co-3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因和哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因先分别以真核表达载体为出发载体，分别构建得到表达《_3脂肪酸去饱和酶基因的重组表达载体、表达哺乳动物脂肪酸延长酶基因的重组表达载体和表达哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因的重组表达载体，然后三个重组表达载体共转染哺乳动物细胞系，筛选得到所述哺乳动物转基因细胞系；所述真核表达载体为pCAGGS，pCAGGS购自addgene公司，其序列已由该公司公布。所述重组表达载体是以真核表达载体为出发载体，将所述真核表达载体先插入抗性筛选标记基因，构建具有抗性筛选标记的重组表达载体，然后插入所述《_3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因或哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因，获得表达《_3脂肪酸去饱和酶基因的重组表达载体、表达哺乳动物脂肪酸延长酶基因的重组表达载体或表达哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因的重组表达载体；所述抗性筛选标记基因zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5,端第564-938位核苷酸，优选为自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核 苷酸，优选序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，优选自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。上述方法制备的哺乳动物转基因细胞系也属于本发明的保护范围本发明所提供的促进哺乳动物细胞生产DHA的方法，是利用上述试剂盒制备哺乳动物转基因细胞系，促进该转基因细胞系生产DHA，具体步骤包括I)利用上述试剂盒按照上述的方法制备DHA生产能力提高的哺乳动物转基因细胞系；2)以花生四烯酸为底物培养步骤I)所述的哺乳动物转基因细胞系，获得细胞内DHA积累量提高的哺乳动物细胞。所述培养哺乳动物转基因细胞系所用的培养基为添加花生四烯酸的动物细胞培养基，所述动物细胞培养基为添加终浓度为10% (体积百分含量)小牛血清，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸的DMEM培养基；所述花生四烯酸在所述添加花生四烯酸的动物细胞培养基中的终浓度为25-75umol/L，优选50umol/L。所述方法还包括提取培养后的哺乳动物细胞的脂肪酸，获得DHA含量提高的脂肪酸。上述L-谷氨酰胺的添加量为2mM ;非必需氨基酸的添カロ量为 L-Alanine 15mg/L, L-Asparagine H208. 9mg/L L-Aspartic acid 13. 30mg/L, L-Glutamic acid 14. 70mg/L, Glycine7. 50mg/L, L-Proline 11. 50mg/L, L-Serine10.50mg/L。所述方法中，所述培养时间为48-96小时，优选72小时。本发明所提供的试剂盒可以用于制备DHA生产能力提高的哺乳动物转基因细胞系，或者转入哺乳动物体内(使用显微注射方法及体细胞克隆方法获得上述试剂盒中的三种基因在动物染色体上稳定整合及表达的转基因动物)提高动物体内DHA含量。本发明促进哺乳动物细胞生产DHA的方法将所述试剂盒中的线虫(Caenorhabditis briggssae)的 _3脂肪酸去饱和酶基因如(如sfat-1)与哺乳动物脂肪酸延长酶基因(如elovl2)及哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因(如A6desaturase)三者共同转入哺乳动物细胞，获得转基因的哺乳动物细胞系，将该细胞系以花生四烯酸为底物进行培养，在转基因的哺乳动物细胞中生成丰富的DHA。原理是将线虫C. briggssae的《_3脂肪酸去饱和酶基因sfat_l、哺乳动物脂肪酸延长酶基因elovl2、哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因A6desaturase在哺乳动物细胞中共表达，以花生四烯酸为出发原料，经sfatl转化成EPA，再经elovl2和A 6desaturase进行碳链的延伸和去饱和作用，生成DHA。在这个过程中，通过供给充足的底物，经过转入的三个基因的共同作用，使细胞内的反应方向由底物向产物方向进行，从而在哺乳动物细胞中或转基因动物体内生成丰富的DHA。通过对CHO-kl细胞的实验证明，该方法促进哺乳动物细胞DHA的生成，使细胞脂肪酸中的DHA产量大大增加，由占细胞总脂肪酸的I. 02%增加到7. 31%。


图I为陆生哺乳动物从植物中摄取18碳的a -亚麻酸微量地转化为EPA和DHA 的过程示意2为pCAGGS-sfatl-zeo表达载体示意3为pCAGGS-sfatl-zeo表达载体NcoI酶切鉴定4为pCAGGS-elovl2_neo表达载体示意5为pCAGGS-elovl2_neo表达载体EcoRI和KpnI双酶切酶切鉴定6 为 pCAGGS- A 6desaturase_hygro 表达载体不意7 为 pCAGGS- A 6desaturase_hygro 表达载体 EcoRI、NcoI、PvuI 单酶切酶切鉴定8 为 A 6desaturase (通过表达载体 pCAGGS-A 6desaturase_hygro)、elovl2 (通过表达载体 pCAGGS-elovl2_neo)、sfatl (通过表达载体 pCAGGS-sfatl-zeo)三基因共转CHO-Kl细胞的阳性单细胞克隆的RT-PCR鉴定。图8中，1-4 :无模板对照，5_8 :转染三种空载体的CHO-Kl单细胞克隆，9-12和13-16 :转染三种表达载体的阳性单克隆13号和 28 号。1、5、9、13 扩增 A6desaturase 基因，2、6、10、14 扩增 elovl2 基因，3、7、11、15 扩增sfatl基因，4、8、12、16扩增内參GAPDH基因。图9为转染单个sfatl表达载体和共转染三基因表达载体的CHO-Kl单克隆细胞的气相色谱-质谱(GC-MS)脂肪酸测定图；3 :单转染sfatl的CHO-Kl单克隆的脂肪酸测定。DHA峰出现在27. 13的位置，含量占总脂肪酸的I. 02% ；2 :转染三种基因的CHO-Kl单克隆的脂肪酸測定。DHA峰出现在27. 22的位置。与对照相比，转染三种基因的CHO-Kl细胞中生成了更为丰富的DHA，含量占总脂肪酸的7. 31%。
具体实施例方式我们研究组克隆了来自于线虫(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去饱和酶基因sfat-Usimilar to fat_l)，研究表明该基因在哺乳动物细胞和转基因猪中均能有效地把《 -6多不饱和脂肪酸(《 -6PUFAS)转变成《 -3多不饱和脂肪酸(《 -3PUFAs)，在我们制备的sfat-1转基因猪肌肉组织中，生成的20碳的EPA约占总脂肪酸含量的16%，DHA约占总脂肪酸含量的4%。sfat-1和fat_l基因功能的研究提示我们，来自于线虫的这两个基因在哺乳动物细胞中最适合转化生成20碳的EPA，而DHA的生成量依然远低于EPA。很有意思的是，在我们的转基因猪肌肉组织的脂肪酸測定结果中，我们发现20碳的EPA的确是来源于20碳的花生四烯酸，即20碳的花生四烯酸在sfatl基因产物的催化下，去饱和生成了 20碳的EPA，从结果中可以看到花生四烯酸的大幅度減少和EPA的大幅度生成，两者之间存在明确的此消彼长关系。而DHA尽管也达到了占总脂肪酸4%的含量，但是在GC-MS图上并看不到上述此消彼长的现象，事实上，生成DHA的22碳的《 6脂肪酸底物原料在猪肌肉中本来就含量极少，不足以作为底物支持4%的DHA产出。因此，我们推测4%的DHA的产出并不是以22碳的《6脂肪酸为原料而生成的，而应该是猪利用内源性的转化系统，以生成的丰富的EPA为原料，经过延长和去饱和两步作用，而生成了 4%的DHA。据此我们推測，如果能够強化这种内源性的延长和去饱和作用，就能够以“接力棒式”的转化方法，把sfat-1基因生成的丰富的EPA转化成DHA，将可能在陆生哺乳动物如猪等体内生成丰富的、具有更高营养价值的DHA。陆生哺乳动物虽然不能自身合成《_3PUFAs，但是可以从植物中摄取18碳的a -亚麻酸微量地转化为EPA和DHA(见图I)，这个过程中包括碳链的延长、去饱和、P -氧化三种步骤。其中碳链的延长和去饱和为限速步骤。在哺乳动物体内，EPA向DHA转化的两个关键酶分别是负责脂肪酸碳链延长的延长酶和负责脂肪酸去饱和的△ 6去饱和酶。在上述研究基础的启迪下，发明人发明了一种生产DHA的方法，将我们克隆的线虫(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去饱和酶基因sfat_l与哺乳动物脂肪酸 延长酶基因elovl2及脂肪酸去饱和酶基因A6desaturase三者共同转入哺乳动物细胞或哺乳动物体内，有可能在转基因的哺乳动物细胞或哺乳动物自身体内生成丰富的DHA。其中转入的sfat-1基因负责生成丰富的EPA，而后两者在強化表达的情况下，增强EPA向DHA转化的效率，从而把前者生成的丰富的EPA转化成丰富的DHA。从而在哺乳动物细胞或哺乳动物体内形成一条DHA生产的高效代谢链。本发明使用三种基因共同联合作用，以花生四烯酸为出发原料，在转基因动物细胞或转基因动物体内生成丰富的DHA。下面以中国仓鼠卵巢细胞K1(CH0-K1细胞)为例，阐明本发明的技术方案。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。内切酶、分子生物学方面的试剂购于Promega公司；其他试剂购自sigma公司；peasy-T 载体购自 promega 公司。elovl2 基因、A 6desaturase 基因购自 openbiosystems公司。中国仓鼠卵巢细胞Kl (CHO-Kl)细胞购自协和医科大学。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例I、利用sfatl、elovl2、A 6desaturase三基因共同转染在CH0-K1细胞中生成丰富DHA的方法。一、pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS- A 6desaturase-hygro> pCAGGS-elovl2_neo 三种高效表达载体的构建。I、pCAGGS-sfatl-zeo 表达载体的构建I)筛选标记zeocin抗性基因的获得质粒pVgRXR(购自invitrogen公司，该公司已公布了其序列)上面带有zeocin抗性基因，我们在zeocin抗性基因cDNA上游设计上游引物P 1(P I :5’ CGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAG3’ ；P I引物扩增的下游序列中带有ー个天然Stu I位点)，在zeocin抗性基因cDNA下游设计下游引物P2 (P2 :5’GAaggcctTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACG 3’ ；带有Stu I位点)，利用上述引物，通过PCR从质粒pVgRXR上扩增获得目的片段，PCR 条件为94°C 4min ；94°C 30sec ；65°C 45sec ；72°C Imin ；30 循环；72°C IOmin ;4°C保存；PCR获得的片段其大小为946bp，其核苷酸序列为序列表中的序列4，自序列表中序列4的5'端第486-563位核苷酸为Em7pix)m0ter ；自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸为zeocin抗性基因cDNA。然后将PCR获得的片段克隆到peasy-T载体上，获得带有zeocin抗性基因cDNA的重组载体命名为peasy_T_zeo。2)pCAGGS_zeo载体的构建使用stul酶切peasy-T-zeo,割下890bp (自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸)的带有zeocin抗性基因的片段，然后克隆到表达载体pCAGGS (addgene公司购买,该公司已公布了其序列)的stul位点中。pCAGGS stul位点的上游有sv40启动子,下游有sv40polyA,可用于插入的zeocin抗性基因的转录表达。3) pCAGGS-sfatl-zeo的构建sfatl基因(Sfatl序列是序列表中序列I所不的序列)由北京中美泰和公司全基因人工合成，合成的sfatl基因克隆在peasy-T载体上，合成的基因两头分别各设计了ー个EcoRI酶切位点。从中美泰和公司获得的peasyT-sfatl载体上，使用EcoRI切出I. 2Kb的线虫的《_3脂肪酸去饱和酶基因sfat_l，使用EcoRI切开上述的pCAGGS-zeo载体，将I. 2Kb的sfatl基因克隆进pCAGGS-zeo载体，最终获得pCAGGS-sfatl-zeo表达载体(载体结构示意图如图2所示)。使用NcoI对最终 获得的pCAGGS-sfatl-zeo表达载体进行酶切鉴定，应获得2901bp，1805bp, 1578bp，600bp4个片段，酶切结果与设想的完全一致，具体的酶切鉴定图如图3所示，证明最终获得的表达载体是正确的，序列測定结果也证实了表达载体构建的正确性。图3中，泳道1-5为pCAGGS-sfatl-zeo的酶切结果，泳道MIV为分子量marker。2> pCAGGS-elovl2-neo 表达载体的构建l)pCAGGS-neo 载体的构建质粒 peasyfiox(购自 addgene 公司，addgene 公司已公布了其序列)上带有完整的筛选标记neomycin抗性基因表达框架，neomycin抗性基因表达框架在neomycin抗性基因的上游有pGK启动子，下游有bGH polyA。我们使用XhoI和BamHI双酶切,切下2. IKb的neomycin抗性基因表达框架,该neomycin抗性基因表达框架的核苷酸序列为序列表中的序列5 (自序列表中序列5的5'端第7-566位核苷酸为pGK启动子，自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸为neomycin抗性基因，自序列表中序列5的5'端第1371-2107位核苷酸为bGH polyA序列)，末端平头化后，连接到pCAGGS的stul位点中，可表达neomycin抗性基因的重组载体,命名为pCAGGS_neo载体。2) elovl2基因的克隆小鼠elovl2基因购买自openbiosystems公司，其序列为序列表中序列2所示的序列，根据其序列设计ー对引物P3和P4，P3 (5’CGgaattcATGGAGCAGCTGAAGGCCITTGA3’)带有ー个 EcoRI 位点，P4(5’GGggtaccTTAITGAGCCTTCTTGTCCGTC3’)带有ー个KpnI位点，以购买的小鼠elovl2基因为模板，进行PCR扩增，扩增条件94°C 4min ；94°C 30sec ；62°C 45sec ；72°C Imin ;30 循环；72°C IOmin ;4°C保存。扩增出大小为 879bp 的elovl2基因，将该扩增得到的基因克隆入peasy-T载体中，得到表达elovl2的重组载体，命名为 peasy_T_elovl2 载体。3)使用 EcoRI 和 KpnI 从 peasy_T_elovl2 载体中切下 879bp 的 elovl2 基因，克隆入pCAGGS-neo载体的EcoRI和KpnI位点中，最终得到pCAGGS-elovl2_neo表达载体(载体结构示意图如图4所示)。使用EcoRI和KpnI对最终获得的pCAGGS-elovl2_neo表达载体进行酶切鉴定，应切出879bp和6717bp两个片段，酶切结果与设想的完全一致，具体酶切结果如图5所示，证明最终获得的表达elovl2基因的pCAGGS-el0V12-ne0表达载体是正确的，序列测定结果也证实了表达载体构建的正确性。pCAGGS-el0V12-ne0中的elovl2序列为序列表中序列2所示的序列。图5中，泳道MIV为分子量marker。3、pCAGGS- A 6desaturase-hygro 表达载体的构建I)筛选标记hygro抗性基因的获得质粒pcDNA3. 1/hygro (购自invitrogen公司，该公司已公布了该载体的序列)上带有hygro基因，我们在hygro cDNA上游设计上游引物P5 (5，AGTTCCGCCCATTCTC3，)，引物P5下游有天然的stul酶切位点。在hygrocDNA 下游设计下游引物 P6 (5，GAaggcctCTAITCCTTTGCCCTCGG3’ ；带有 Stu I 位点)，以质粒pcDNA3. 1/hygro为模板，利用P5和P6为引物，通过PCR扩增获得目的片段hygro，其大小为1209bp，其核苷酸序列为序列表中序列6(自序列6的5'端第1-124位核苷酸为SV40promoter/ori,自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸为hygro抗性基因)PCR 条件为94で 4min ；94°C 30sec ；52°C 45sec ；72°C Imin ;30 循环；72で IOmin ;4で保存。将获得的PCR产物克隆到peasy-T载体上，获得序列中含有hygro序列的重组载体，命名为peasy-T-hygrOo2)pCAGGS-hygro载体的构建利用引物两头自带的stul位点，使用stul酶切peasy-T-hygro,割下1093bp(自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸)的含有hygro基因的片段,然后将hygro克隆到表达载体pCAGGS的stul位点中获得重组表达载体。pCAGGS stul位点的上游有sv40启动子,下游有sv40polyA,可用于插入的hygro基因的转录表达。将验证正确的可表达hygro基因的重组表达载体命名为pCAGGS-hygro。3) A 6desaturase 基因的克隆小鼠 A 6desaturase 基因(A 6desaturase 序列为序列表中序列3所示的序列)购买自openbiosystems公司，设计ー对引物P7和P8,P7 (5’CGgaattcATGGGGAAGGGAGGTAACCAG 3，)带有ー个 EcoRI 位点，P8 (5，CCGgagctcTCAITTATGGAGGTAAGCATCCAG3’)带有ー个SacI位点，以小鼠A 6desaturase基因为模板，以P7和P8为引物进行 PCR 扩增，PCR 条件为94°C 4min ；94°C 30sec ；62°C 45sec ；72°C Imin ;30 循环；72V IOmin ;4°C保存。扩增出大小为1335bp的A 6desaturase基因，克隆入peasy-T载体中，得到序列中含有小鼠A 6desaturase基因的重组表达载体，将验证正确的载体命名为peasy-T- A 6desaturase 载体。4)使用 EcoRI 和 SacI 从 peasy-T-A 6desaturase 载体中切下 I33Sbp 的A 6desaturase基因，克隆入pCAGGS-hygro载体的EcoRI和SacI位点中，最终得到pCAGGS-elovl2_neo表达载体(载体结构示意图如图6所示)。使用EcoR I、Nco I、Pvu I对最终获得的pCAGGS-A6desaturase_hygro表达载体进行酶切鉴定,EcoR I应切出2569bp,4659bp两个片段；Nco I应切出3518bp，320Ibp，509bp三个片段；Pvu I应切出2261bp，4967bp两个片段，酶切结果与设想的完全一致，具体结果如图7所示，结果证明最终获得的表达载体pCAGGS-A 6desaturase_hygro是正确的可表达A6desaturase的重组载体，序列测定结果也证实了表达载体构建的正确性。pCAGGS-A 6desaturase_hygro载体中的A6desaturase序列为序列表中序列3所示的序列。图7中，泳道MII和MIV均为分子量markeroニ、共转染表达sfatl、elovl2以及A 6desaturase的表达载体的阳性CH0-K1转基因细胞系的构建
I、CH0-K1细胞的培养将CH0-K1细胞解冻，放入6孔板中培养。使用动物细胞培养基(添加终浓度为10% (体积百分含量)FBS(小牛血清，购自hyclone公司，货号SH30084. 03), I X L-glutamine (100 X L-谷氨酰胺，200mM,使用时稀释100倍即为I XL-glutamine ；购自 hyclone 公司，货号 SH30034. 01), I XNon-Essential AA(100X非必需氨基酸，使用时稀释100倍即为I XNon-Essential AA ;购自hyclone公司，货号 SH30238. 01 ；100X 非必需氨基酸的组分为L-Alaninel500mg/L, L-Asparagine H2O890mg/L L-Aspartic acid 1330mg/L, L-Glutamic acidl470mg/L, Glycine 750mg/L,L-Proline 1150mg/L, L-Serine 1050mg/L)的 DMEM 培养基(购自 hyclone 公司，货号SH30022. OlB))，于37°C，5% CO2培养箱中培养CHO-Kl细胞。待细胞生长到约90%的汇合度时，用于下述转染步骤。2、CHO-Kl细胞的转染第一步先使用pCAGGS-sfat l-zeo表达载体进行转染，在获得sfatl基因稳定整合的单细胞克隆的基础上，再进行第二步的转染，即使用后两种表达载体pCAGGS-elovl2_neo表达载体和pCAGGS- A 6desaturase-hygro表达载体进行共转染。具体转染的方法如下所述转染前使用QIAGEN的质粒大提试剂盒提取上述三种表达载体，三种质粒均使用AhdI酶切进行线性化，按照每个6孔细胞使用4ug的DNA量进行转染实验,取5ul DNA混合液与IOul脂质体Iipptectamine 2000混勻进行转染,转染6小时后更换新鲜培养基，24小时后以I : 10(或更高的稀释比)传代，再24h后添加抗性素(G418、博莱霉素或潮霉素)的动物细胞培养基进行筛选，使用的G418 (筛选转染pCAGGS-sfatl-zeo的细胞)筛选浓度为800iig/ml，博莱霉素(筛选转染pCAGGS-el0V12-ne0的细胞)浓度为600 ii g/ml,潮霉素(筛选转染 pCAGGS-A 6desaturase_hygro 的细胞)浓度为 350 ii g/ml。在添加上述浓度的抗生素的动物细胞培养基的抗性压力下培养7-10d后进行单克隆细胞的筛选，将细胞分散到96孔板中，每个孔只有一个细胞，期间一直用抗性培养基培养细胞，培养时间为2个月，得到稳定的转染pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS_A6 desaturase-hygro和pCAGGS-elovl2-neo的阳性CH0-K1转基因单细胞克隆。同时将pCAGGS-zeo、pCAGGS_neo和pCAGGS-hygro分别按照上述转染方法转入CH0-K1细胞中，获得转pCAGGS-zeo、pCAGGS-neo和pCAGGS-hygro三种空载体的单细胞克隆作为转空载体对照。3、阳性CH0-K1单克隆细胞的鉴定使用RT-PCR的方法鉴定步骤2获得的转染了 pCAGGS-sfatl-zeo、pCAGGS-A6desaturase_hygro 和 pCAGGS-elovl2_neo 的阳性 CH0-K1 转基因单细胞克隆。设计引物 P9 (5，CTCTGACTGACCGCGTTACTCCCAC 3’ )，位于 pCAGGS 中的鸡 a -actin 第一外显子的上。引物 P10(5’ CCAGTCCCGGTAGTGATCAAGATC 3’)，位于 A 6desaturase 基因内部；引物 Pll (5，CCTTCTTGTCCGTCATGCCATTAG 3’)，位于 elovl2 基因内部；引物 P12(5’ GTTGGTGAAAGCGTGGTGAAGITTG3’)位于 sfatl 基因内部。引物 P13 (5，CTGGCCAAGGTCATCCATGACAACC3’ )和 P14(5’ CTGTTGCTGTAGCCGTATTCATTGTC3 )位于内源性參照基因 GAPDH 内部。使用Trizol方法提取CH0-K1单克隆细胞中的总mRNA，使用oligo-dT反转录后，反应条件为30°C IOmin ；42°C 60min ；1个循环；4°C保存。三个基因的转录分别进行RT-PCR鉴定，其中P9和PlO用于A6desaturase基因转录的鉴定，PCR条件为94°C 4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循环；72°C IOmin ;4°C保存。阳性细胞克隆应该扩增出IlOObp片段。P9和 Pll 用于 elovl2基因转录的鉴定，PCR条件为MV 4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循环；72°C IOmin ;4°C保存。阳性细胞克隆应该扩增出950bp片段。P9和P12用于 sfatl 基因转录的鉴定，PCR条件为94°C 4min ；94°C 30sec ；65°C 45sec ；72°C Imin ；30循环；72°C IOmin ;4°C保存。阳性细胞克隆应该扩增出571bp片段。P13和P14用于内源性參照GAPDH基因转录的鉴定，PCR条件为94°C4min ；94°C 30sec ；58°C45sec ；72°C Imin ;30循环；72°C IOmin ；4°C soak。应扩增出500bp的片段，作为内源性參照。以上述转pCAGGS-zeo、pCAGGS-neo和pCAGGS-hygro三种空载体的单细胞克隆作为转空载体对照。结果如图8所示，结果显示我们获得了 6株共转染有三个基因的CHO-Kl单克隆细胞株，三个基因都稳定整合在CHO-Kl细胞染色体上，且三个基因都能高效地进行转录表达。图8中仅给出阳性单克隆13号和28号为例。三、CHO-Kl细胞中的脂肪酸测定I. CHO-Kl转基因细胞系的培养 挑选I株三基因共转的CHO-Kl单克隆细胞(阳性单克隆13号)进行脂肪酸的测定，以单转有sfatl的CHO-Kl单克隆细胞株为对照。将所获得的单克隆细胞按小于10%的比例传代培养至150 X 150mm的大培养皿，每皿加入30mL无抗性动物细胞培养基(添加终浓度为10% (体积百分含量)FBS (小牛血清，购自hyclone公司，货号SH30084. 03)，I XL-glutamine (L-谷氨酸胺，购自 hyclone 公司，货号 SH30034. 01)，I XNon-EssentialAA (非必需氨基酸，购自hyclone公司，货号SH30238. 01)的DMEM培养基(购自hyclone公司，货号SH30022. 01B))，以50umol/L的终浓度在培养基中加入花生四烯酸。加入动物细胞培养基和底物72h内不做任何处理，静态观察细胞的生长状況。72h后收集细胞进行脂肪酸的抽提。2. CH0-K1细胞脂肪酸抽提及甲酯化用胰酶消化，离心收集2个大培养皿中的细胞(转染)。加入氯仿和甲醇(氯仿和甲醇体积比为I : I) 4mL混匀，摇匀至细胞均匀散开。加入3. 5mL蒸馏水摇匀，3500r/min，室温离心5min，分层后吸取下层氯仿(含全部脂肪酸)。残液中再次加氯仿3mL抽提，再次3500r/min，室温离心5min后吸取下层氯仿层。将两次收集的液体3500r/min，室温(25°C )离心5min，吸取下层液体，用氮气将其吹干。向其加入ImL氯仿重溶后再次用氮气吹干。加入Iml 2. 5%硫酸/甲醇溶液(在甲醇中加入2. 5ml的硫酸,用甲醇定容到IOOml))混勻，70°C加热I小时，期间轻摇不要晃到管壁。冷却到室温，加入ImL去离子水和ImL正己烷，用カ振摇晃勻，2500r/min,室温离心5min,小心吸取上清(正己烧层)。在残液中加入ImL正己烷再次抽提，2500r/min,室温离心5min，再次吸取上清(正己烷层)。将两次的上清液混在一起用氮气吹干得到脂肪酸。3.脂肪酸的气相色谱-质谱测定将步骤2获得的脂肪酸用ImL正己烷吹打冲洗后装入I. 5mL离心管，吸取上清(0. 8mL)经氮气吹干后用于GC-MS分析，使用仪器为GC-TOF高分辨气质联用仪。分析条件气相色谱仪(GC) :HP6890 ;色谱柱DB-5，30mX0. 25mmX0. 25ii L ;恒流进样；进样体积 Iu し进样ロ温度 260°C ;升温程序为 50°C— 160°C (30°C /min) — 240°C (8°C /min) 280°C (30°C /min)载气He,流速lmL/min。外标法校正仪器。EI+离子源，源温180°C，质谱轰击电子能量为70eV，质量扫描范围20 800U.谱库检索=MassLynx和NIST。CH0-K1细胞脂肪酸的气相色谱-质谱结果显示与只转入表达sfatl的CH0-K1细胞对照相比，共转染并表达sfatl、elovl2、A6desaturase三种外源基因的CH0-K1细胞中生成了更为丰富的DHA，单转染sfatl的CH0-K1细胞中DHA的含量占总脂肪酸的比例为1. 02%，而共转染并表达三种外源基因的CHO-Kl细胞中DHA的含量占总脂肪酸的比例达到了 7. 31 %， 效果非常明显，显示动物细胞培养基中添加的花生四烯酸被更有效地转化成DHA。
权利要求
1.一种促进哺乳动物细胞生产DHA的试剂盒,包括线虫(Caenorhabditis briggssae) -3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因和哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述线虫(Caenorhabditis briggssae)的w-3脂肪酸去饱和酶基因为sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列为序列表中序列I ;所述哺乳动物脂肪酸延长酶基因为小鼠脂肪酸延长酶基因，优选为小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列为序列表中序列2 ;所述哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因为小鼠脂肪酸去饱和酶基因，优选为小鼠Aedesaturase基因，所述小鼠A6desaturase基因的核苷酸序列为序列表中序列3。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还包括真核表达载体，所述真核表达载体为pCAGGS ;所述试剂盒还包括抗性筛选标记基因；所述抗性筛选标记基因包括zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，优选为自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，优选序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，优选自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。
4.一种制备DHA生产能力提高的哺乳动物转基因细胞系的方法，是将线虫(Caenorhabditis briggssae) w-3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因、哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因导入离体的哺乳动物细胞中，筛选获得稳定整合及表达《_3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因、哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因的哺乳动物转基因细胞系，即为DHA生产能力提高的哺乳动物转基因细胞系。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于所述线虫(Caenorhabditisbriggssae)的《_3脂肪酸去饱和酶基因为sfatl基因，所述sfatl基因的核苷酸序列为序列表中序列I;所述哺乳动物脂肪酸延长酶基因为鼠脂肪酸延长酶基因，优选为小鼠elovl2基因，所述小鼠elovl2基因的核苷酸序列为序列表中序列2 ;所述哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因为鼠脂肪酸去饱和酶基因，优选为小鼠A6desaturase基因,所述小鼠A 6desaturase基因的核苷酸序列为序列表中序列3 ;所述哺乳动物细胞为鼠细胞，优选为中国仓鼠卵巢细胞K1。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述《_3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因和哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因先分别以真核表达载体为出发载体，分别构建得到表达Co-3脂肪酸去饱和酶基因的重组表达载体、表达哺乳动物脂肪酸延长酶基因的重组表达载体和表达哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因的重组表达载体，然后三个重组表达载体共转染哺乳动物细胞系，筛选得到所述哺乳动物转基因细胞系；所述真核表达载体为pCAGGS。
7.根据权利要求6中任意一项所述的方法，其特征在于所述重组表达载体是以真核表达载体为出发载体，将所述真核表达载体先插入抗性筛选标记基因，构建具有抗性筛选标记的重组表达载体，然后插入所述《_3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因或哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因，获得表达《_3脂肪酸去饱和酶基因的重组表达载体、表达哺乳动物脂肪酸延长酶基因的重组表达载体或表达哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因的重组表达载体；所述抗性筛选标记基因为zeocin抗性基因、neomycin抗性基因或hygro抗性基因；所述zeocin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列4的5'端第564-938位核苷酸，优选为自序列表中序列4的5'端第52-941位核苷酸；neomycin抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列5的5'端第567-1370位核苷酸，优选序列表中序列5 ；hygro抗性基因的核苷酸序列是自序列表中序列6的5'端第178-1203位核苷酸序列，优选自序列表中序列6的5'端第114-1206位核苷酸。
8.权利要求4-8中任意一项所述方法制备的哺乳动物转基因细胞系。
9.一种促进哺乳动物细胞生产DHA的方法，包括下述步骤 1)按照权利要求4-8中任意一项所述的方法制备哺乳动物转基因细胞系； 2)以花生四烯酸为底物培养所述的哺乳动物转基因细胞系，获得细胞内DHA积累量提高的哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述培养权利要求8所述的哺乳动物转基因细胞系所用的培养基为添加花生四烯酸的动物细胞培养基，所述动物细胞培养基为添加终浓度为10% (体积百分含量)小牛血清，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸的DMEM培养基；所述花生四烯酸在所述添加花生四烯酸的动物细胞培养基中的终浓度为25-75umol/L，优选50umol/L ;所述方法还包括提取培养后的哺乳动物细胞的脂肪酸，获得DHA含量提高的脂肪酸。
全文摘要
本发明公开了一种促进哺乳动物细胞生产DHA的方法。该方法下述步骤1)制备DHA生产能力提高的哺乳动物转基因细胞系；2)以花生四烯酸为底物培养所述的哺乳动物转基因细胞系，获得细胞内DHA积累量提高的哺乳动物细胞。其中制备DHA生产能力提高的哺乳动物转基因细胞系的方法，是将ω-3脂肪酸去饱和酶基因、哺乳动物脂肪酸延长酶基因、哺乳动物脂肪酸去饱和酶基因导入哺乳动物细胞中，筛选获得表达三种基因的哺乳动物转基因细胞系。
文档编号C12N15/85GK102660576SQ20121010702
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者吴晓洁, 周颜荣, 孙晓燕, 左珊珊, 林艳丽, 熊富银, 陈红星 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所