专利名称：一定长度的单链polyA RNA分子设计与制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一定长度的polyA分子的制备方法和该类polyA分子在抑制外源基因表达中的作用。
背景技术：
真核生物mRNA的3’端通常都有20-200个腺苷酸残基，构成多聚腺苷酸的尾部结构，即polyA尾巴。高等真核生物中RNA聚合酶II转录终止发生在成熟转录本的3’端下游几千碱基之后，其精确机制目前还不清楚；而后3’端通过内切，在高度保守的多腺苷酸化位点(AAUAAA)后10-30碱基位点处加上不同数量的腺嘌呤，形成polyA尾巴。核内hnRNA3’端也有polyA结构，并且比mRNA略长，平均长度为150-200个核苷酸，这表明了RNA转录后修饰的加尾过程早在核内已经完成。
这种polyA加尾的功能也不很明确，但可以从以下几方面得到启示1)多聚腺苷酸化可被类似物3’-脱氧腺苷所阻止。这种阻止作用并不影响核hnRNA的转录，但可阻止细胞质中出现新的mRNA。这表明多聚腺苷酸化对mRNA成熟是必要的。2)珠蛋白mRNA上的polyA尾巴被去除后，仍然能在麦胚无细胞系统中翻译，显示该尾部结构并不是翻译必需；然而去除polyA尾巴后的mRNA稳定性明显降低，翻译效率下降。当mRNA由细胞核转移到细胞质中时，polyA尾巴常有不同长度的缩短。由此可见，polyA尾巴至少起着某种缓冲作用，防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解作用。3)polyA尾巴与相关蛋白的结合促进mRNA由核向质的转移。
mRNA进入细胞质后，polyA尾巴的“命运问题”更是缺乏明确的解释。polyA准确的以何种方式降解，是单个腺嘌呤逐一去除，还是随机去除？那么细胞质中是否存在不同长度的polyA片断分子？我们结合相关研究进展和自身工作基础，涉及并合成了不同长度的polyA RNA分子，依靠脂质体转染入细胞中，得到了polyA RNA分子在外源基因表达调控相关信息，并实施于抑制外源基因表达的应用中。
发明内容
本发明目的在于提出一定长度单链polyA RNA分子的制备，并提出该类polyARNA分子在抑制外源基因表达中的作用。
本发明通过以下技术方案实现首先设计带有T7转录启动子的polyA的DNA转录模板，经体外转录纯化后获得polyA RNA分子。然后采用脂质体包裹的方法将polyA与表达相应外源基因的真核载体共转染入细胞。48小时后，观察和检测对照组与实验组的外源基因蛋白质表达水平和mRNA转录水平。
本发明涉及的polyA长度为10-100个连续的A。
本发明阐述了当polyA长度达到60时，明显抑制外源基因的表达，而对于内源稳定表达基因无明显影响。这种特性使得单链polyA RNA分子在生物医学中具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。
图1不同长度polyA分子电泳图1.10A 2.20A 3.30A 4.40A 5.50A 6.60A图2不同长度polyA分子对外源GFP表达影响的荧光观察结果图3不同长度polyA分子对外源GFP的mRNA影响，RT-PCR电泳图1.10A 2.20A3.30A 4.40A 5.50A 6.60A 7.control图4不同长度polyA分子对内源稳定表达GFP的mRNA影响，RT-PCR电泳图1.10A2.20A 3.30A 4.40A 5.50A 6.60A 7.control图5polyA，polyU，polyG，polyC，polyN对外源GFP表达影响的荧光观察结果图6polyA，polyU，polyG，polyC，polyN对外源GFP mRNA影响，RT-PCR电泳图1.polyA2.polyU 3.polyG 4.polyC 5.control具体实施方式
以GFP(绿色荧光蛋白)为检测基因，与单链polyA RNA分子共转染来描述本发明在抑制外源基因表达中的作用。
1、polyA分子以及所用对照RNA分子的DNA的转录模板的设计与合成(见序列表)10A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAAAAAAAAAA3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTTTTTTTTT5′20A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT5′30A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT5′40A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-40A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-40T5′
50A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-50A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-50T5′60A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60T5′5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-50A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-50T5′100A5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-100A3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-100T5′60U5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60T3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60A5′60G5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60G3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60C5′60C5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60C3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60G5′60N(N表示随机序列)5′GCATGCTAATACGACTCACTATAGGG-60N3′3′CGTACGATTATGCTGAGTGATATCCC-60n5′将上述相互匹配的单链DNA(1ug/ul)于20ul体系中95℃加热5分钟，37℃放置30分钟退火形成双链DNA。
2、制备polyA RNA5×转录缓冲液400mM HEPES-kOH，120mM Mgcl2，10mM spermidine，200mM DTTrNTP25mM each T7RNA聚合酶(10u/ul)，RNAase抑制剂(50u/ul)1)按照下述转录体系进行反应5×转录缓冲液8ulrNTP8ul
T7RNA聚合酶3ulDNA模板6ulRNAase抑制剂1ulDEPCH2O14ul37℃，4小时加入4u无RNAase的DNAase，37℃消化30分钟。
2)加入1/5体积10M的醋酸铵，2.5倍体积的无水乙醇，于-20℃沉淀1小时。4℃离心回收沉淀，70％乙醇清洗沉淀。
3)重复步骤2)一次，用DEPC H2O溶解沉淀，测定A260/A280，定量。2％琼脂糖胶电泳鉴定(图1)3、polyA对外源GFP表达影响3.1细胞培养将生长在DMEM中状态良好的MCF-7细胞用胰酶消化后重新种植于24孔板中，每孔细胞数为1×105个，500ul体积。37℃，5％CO2条件下培养24小时。
3.2核酸转染每种polyA的用量均为30pmol/孔，用酵母tRNA补充每孔RNA总量为1ug。与RNA共转染的GFP表达载体pEGFP-N2用量为100ng/孔。脂质体lipofectamineTM2000(invitrogen)用量为2ul/孔。
将需转染核酸用50ul无血清DMEM稀释混匀，同时也将2ul脂质体用50ul无血清DMEM稀释，再将两者合并混匀，室温静置20分钟后，加入24孔板中。细胞继续培养6小时后，更换新鲜DMEM(10％FBS)培养基。
3.3转染48小时后，在荧光显微镜(奥林巴斯IX71)下观察GFP表达状况(图2)。
3.4RT-PCR分析GFP mRNA水平3.4.1300ul TRIzol(invitrogen)直接加入24孔板中提取每孔细胞RNA。
3.4.2按照如下体系进行反转录反应总RNA500ngOligodT18(500ng/ul)1ul5×buffer4ulM-MLV反转录酶(100u/ul)；0.5ulRNAase抑制剂1ul加DEPCH2O至20ul
42℃，1小时。95℃，加热10分钟灭活反转录酶3.4.3PCRGFP引物forward5’-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCATC；reverse5’-TCACCTTGATGCCGTTCTTCTGβ-actin引物forward5′CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3′；reverse5′ATCATGTTTGAGACCTTCAACA5′按照如下体系进行PCR反应；10×PCR缓冲液2uldNTP(2.5mM each)1.6ul引物(mix)0.4ulTaq酶(25u/ul)0.4ulcDNA模板2ulH2O13.6H2O95℃3分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃10分钟2％琼脂糖电泳鉴定结果(图3)4、polyA对于内源GFP表达影响如上制备的10A，20A，30A，40A，50A，60A同样以30pmol/孔(24孔板)的固定摩尔质量转染入稳定表达GFP的MCF-7细胞(本实验室经G418筛选，GFP阳性表达率70％以上)。48小时观察GFP荧光强度。提取总RNA，RT-PCR分析GFPmRNA水平(图4)。
5、比较polyA，polyU，polyG，polyC对于外源GFP的表达影响如上制备60A，60U，60G，60C，60N。每种RNA用量均为30pmol/孔(24孔板)，与RNA共转染的GFP表达载体pEGFP-N2用量为100ng/孔。脂质体lipofectamineTM2000(invitrogen)用量为2ul/孔。
48小时观察GFP荧光强度(图5A)。提取总RNA，RT-PCR分析GFPmRNA水平(图5B)。
实验结果1、polyA长度达到60时明显抑制外源GFP的表达，并且表现mRNA水平的降低。
2、60A对于内源GFP的表达与对照比较无显著差异3、polyU，polyG，polyC不具备这种抑制作用，为polyA特性。
序列表<110>军事医学科学院医学基础所<120>带有单链polyA尾巴的siRNA分子制备方法和应用<130>
<160>22<210>1<211>36<212>DNA<213>
<400>1GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAAAA AAAAAA 36<210>2<211>36<212>DNA<213>
<400>2TTTTTTTTTT CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC 36<210>3<211>46<212>DNA<213>
<400>3GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA46<210>4<211>46<212>DNA<213>
<400>4TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC46<210>5<211>56<212>DNA<213>
<400>5GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA50AAAAAA56<210>6<211>56<212>DNA<213>
<400>6TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CCCTATAGTG AGTCGTATTA50
GCATGC 56<210>7<211>66<212>DNA<213>
<400>7GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA50AAAAAAAAAA AAAAAA 66<210>8<211>66<212>DNA<213>
<400>8TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CCCTATAGTG50AGTCGTATTA GCATGC 66<210>9<211>76<212>DNA<213>
<400>9GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA50AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 76<210>10<211>76<212>DNA<213>
<400>10TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT50CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC 76<210>11<211>86<212>DNA<213>
<400>11GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA50AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 86<210>12<211>86
<212>DNA<213>
<400>12TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT50TTTTTTTTTT CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC 86<210>13<211>126<212>DNA<213>
<400>13GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA50AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA100AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 126<210>14<211>126<212>DNA<213>
<400>14TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT50TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT100
CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC 126<210>15<211>86<212>DNA<213>
<400>15GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT50TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTT 86<210>16<211>86<212>DNA<213>
<400>16AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA50AAAAAAAAAA CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC 86<210>17<211>86<212>DNA<213>
<400>17GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG50GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGG 86<210>18<211>86<212>DNA<213>
<400>18CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC50CCCCCCCCCC CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC 86<210>19<211>86<212>DNA<213>
<400>19GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC50CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCC 86<210>20
<211>86<212>DNA<213>
<400>20GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG50GGGGGGGGGG CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC 86<210>21<211>86<212>DNA<213>
<223>n＝a或g或c或t<400>21GCATGCTAAT ACGACTCACT ATAGGGNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN50NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNN 86<210>22<211>86<212>DNA<213>
<223>n＝a或g或c或t<400>22NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN50NNNNNNNNNN CCCTATAGTG AGTCGTATTA GCATGC 8权利要求
1.一系列单链polyA RNA分子，其特征在于由10-100个连续腺嘌呤核苷酸(A)构成。
2.根据权利要求1所述，其中单链polyA RNA分子可以是体外直接化学合成。
3.根据权利要求1所述，其中单链polyA RNA分子可以设计DNA模板体外转录制备。
4.根据权利要求1所述，其中单链polyA RNA分子可以利用载体或线性DNA模板在细胞内产生。
5.根据权利要求1所述，其中polyA长度包含10-100中的任一数目。
6.一种如权利要求1所述结构的polyA RNA分子在抑制外源基因表达及其医药研究领域中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一系列polyARNA分子的设计与制备，以及抑制外源基因表达的应用。本发明体外转录制备单链polyA分子，通过脂质体包裹的方式将polyA分子与外源基因表达载体共转染导入细胞，能有效抑制外源基因的表达，而对内源稳定表达基因无明显效果。本发明在生物医学领域具有广泛应用前景。
文档编号A61K48/00GK1876814SQ200510075159
公开日2006年12月13日 申请日期2005年6月10日 优先权日2005年6月10日
发明者邵宁生, 李洁, 杨光, 沈倍奋, 范明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所