一种高压处理提高胃蛋白酶活力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高压处理提高胃蛋白酶活力的方法。
【背景技术】
[0002] 目前，在蛋白质酶解方面存在着蛋白质酶解敏感性低、蛋白水解不彻底等的瓶颈 及核心问题，严重制约了酶解技术在蛋白质加工中的应用。为了提高蛋白质的酶解效果，通 常在酶解前进行适当的变性处理（如热变性处理），通过改变蛋白质的空间结构，使之更易 于与酶结合，从而改善酶解特性。但是，剧烈的处理方式会影响酶解产物功能活性肽的生物 活性及储藏特性，而超高压技术作为近二十几年来新兴的一项食品非热加工技术，其特点 是在保持制品营养成分和风味的前提下，延长制品的贮藏期、提高安全性、改善组织结构， 尤其在改变蛋白质特性、调节酶活力方面有着突出的优势，是一种有效的处理手段。部分学 者已对其进行了系统的研究，如Heremans K和Belloque J等研究发现，高压处理可通过影 响蛋白质三级、四级结构的非共价键氢键、离子键和疏水键等，使蛋白类酶的结构伸展而变 得松散，从而暴露出更多结合位点，易于酶解反应的进行；Morild E.等研究表明，较低压力 (< 200MPa压力下，保压10~20min)处理可使蛋白类酶活性中心发生凝聚作用，其原因可 能是压力改变了形成酶活性中心基础的蛋白质三级结构，使得完整组织中经常被隔离的酶 和基质相接触，从而加速酶促反应。
[0003] 然而，目前国内外学者在高压处理对酶解反应影响的研究大多集中在蛋白质方 面，而在高压处理对酶活性影响机理方面的研究报道较少。有鉴于此，本发明以胃蛋白酶为 高压处理对象，用高压处理后的胃蛋白酶水解酪蛋白，测定了高压处理后的胃蛋白酶酶活 力及其水解酪蛋白产物的水解度，研究了高压处理对胃蛋白酶酶解特性的影响，以期为进 一步探索超高压促进胃蛋白酶酶解的机理打下基础。
[0004] 目前还没有高压处理提高胃蛋白酶活力方法的专利公开，人们希望发明出高压处 理提高胃蛋白酶活力的方法，实现提高胃蛋白酶活力的目的。
【发明内容】
[0005] 本发明一种高压处理提高胃蛋白酶活力的方法，包括以下步骤：
[0006] 第一步酶溶液的制备称取定量胃蛋白酶溶于pH 1.5的盐酸溶液，使浓度达到 2mg/mL，4°C冷藏，lh内迅速完成高压处理。
[0007] 第二步高压处理将制备的酶溶液经真空包装，随后置于高压处理设备中，于 20°C下，进行lOOMPa压力下保压10-20min的处理。
[0008] 第三步保存将高压处理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0009] 通过本发明的一种高压处理提高胃蛋白酶活力的方法，使胃蛋白酶活力提高了 29 %以上，胃蛋白酶活力显著提高，实现了提高胃蛋白酶活力的目的。
【附图说明】
[0010] 图1是本发明不同压力对胃蛋白酶酶活力及酶解产物水解度影响图；
[0011] 图2是本发明不同保压时间对胃蛋白酶酶活力及酶解产物水解度影响图；
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 :
[0013] 第一步酶溶液的制备称取10g胃蛋白酶溶于pH 1.5的盐酸溶液，使浓度达到 2mg/mL，总体积为5升的胃蛋白酶溶液，在4°C下冷藏。
[0014] 第二步将制备好的胃蛋白酶溶液立即真空包装，然后置于高压处理设备中，于 20°C下，进行lOOMPa压力下保压15min的处理。
[0015] 第三步将高压处理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0016] 实施例2:
[0017] 第一步酶溶液的制备称取2g胃蛋白酶溶于pH 1. 5的盐酸溶液，使浓度达到 2mg/mL，总体积为1升的胃蛋白酶溶液，在4°C下冷藏。
[0018] 第二步将制备好的胃蛋白酶溶液立即真空包装，然后置于高压处理设备中，于 20°C下，进行lOOMPa压力下保压20min的处理。
[0019] 第三步将高压处理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0020] 以上列举的仅是本发明的具体实施例，显然本发明不限于以上实施例，还可以有 其他变形。
[0021] 下面结合科学实验对本发明的效果进一步说明。
[0022] 1试验材料与设备
[0023] 1. 1胃蛋白酶：上海晶纯生化科技股份有限公司，酶活力1 : 15000 ;酪蛋白：北京 索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白：北京赛为思生物技术开发中心；L-酪氨酸：北京奥博 星生物技术有限责任公司。主要试剂：甲醛，三（羟甲基）氨基甲烷，乙二胺四乙酸二钠，甘 氨酸，尿素，5, 5'-二硫双-2-硝基苯甲酸，三氯乙酸，1-苯胺基-8-萘磺酸，铁氰化钾，三氯 化铁，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，无水乙醇，邻苯三酚，邻二氮菲，硫酸亚铁，双氧水等，实 验中所用其他化学试剂均为分析纯。
[0024] 1. 2试验设备
[0025] UHPF_750MPa型超高压处理装置：包头科发新型高科技食品机械有限公司，工 作压力600MPa，功率5KW);多功能真空包装机：山东省诸城市中鼎机械；SHA-C数显水浴 恒温振荡器：江苏省金坛市华峰仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计：上海雷磁仪器厂； KjelteCTM8400全自动凯氏定氮仪：丹麦福斯FOSS Denmark ;TU-1810型紫外分光光度 计：北京普析通用仪器有限责任公司；Cary Fluorescence焚光分光光度计：美国安捷 伦Agilent ;MULTIFUGE XIR型冷冻离心机：德国Thermo ;ALPHA1-2LD型冷冻干燥机：德 国Christ German ;Model 270凝胶色谱仪：英国Malvern ;高效液相色谱仪：美国Waters 600 ;电泳仪：美国Bio-RAD。
[0026] 2试验方法
[0027] 2. 1酶溶液：在测定前，称取定量胃蛋白酶溶于pH 1. 5的盐酸溶液，使浓度达到 2mg/mL，4°C冷藏，lh内迅速完成高压处理。
[0028] 2. 2超高压处理
[0029] 将制备的酶溶液经真空包装（vacuum-packed)，随后置于高压处理设备中，于 20°(：下，进行50、100、150、20010^压力下保压2〇11^11的处理，确定最佳压力；
[0030] 在最佳压力下进行5、10、15、20min保压处理，确定最佳高压处理时间；
[0031] 以未经高压处理（常压0.1 MPa)的样液作为对照。
[0032] 2. 3酶解反应
[0033] 高压处理后的酶溶液中加定量酪蛋白，使酪蛋白浓度达到10mg/mL，酶浓度 1. 75mg/mL，调pHl. 5、于57°C恒温水浴振荡器中酶解4h。酶解结束后沸水浴灭酶lOmin，冷 却至室温，4°C冷藏，测定各指标。
[0034] 3.测定指标
[0035] 3.1胃蛋白酶活力测定
[0036] 依据SB/T 10317-1999,采用福林酚法（folin-phenol method)测定胃蛋白酶酶 活力。酶活力单位的定义：在50°C条件下，lmin水解1克酪蛋白产生1 μ g酪氨酸定义为1 个酶活力单位（U)。
[0037] 3. 2酶解液水解度的测定
[0038] 采用甲醛滴定法，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量瓶中，定容、混匀后取20mL置 于200mL烧杯中，加入60mL去0)2水，用0. 05mol/L标准NaOH溶液滴定至pH 8. 2。加入 10mL甲醛溶液，混匀后再用0. 05mol/L标准NaOH溶液继续滴定至pH 9. 2,同时用蒸馏水代 替酶解液做空白对照。记录所消耗的标准NaOH溶液的体积，计算水解度（DH)。
[0040] 式中，c为标准NaOH溶液浓度，mol/L A为样品消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体 积，mL ;V2为试剂空白消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL ;V3为试剂稀释液取用量，为 lmL(5mL酶解液定容100mL后取用20mL) ;S为底物浓度；W为样品中蛋白质含量，本实验所 用酷蛋白样品中蛋白质含量为87. 34% ;htot为蛋白质中妝键总数mmol/g，酷蛋白中妝键 总数为 8. 2 X 10 3mmol/g。
[0041] 4实验结果
[0042] 4. 1不同压力对酶活力及酶解产物水解度的影响
[0043] 不同压力处理的胃蛋白酶活力及对应处理组（图1中压力为OMPa)酶解酪蛋白的 水解度变化情况见图1。由图可知，与未加压处理样品相比，lOOMPa的压力处理可显著增 强胃蛋白酶活力（P < 〇. 05)，使水解酪蛋白所得产物的水解度显著提高（p < 0. 05)，且在 lOOMPa时酶活力及水解度达到最高，酶活力及水解度分别从空白样的16. 5X 104u、8. 23% 提高到21. 86X 104u、11. 25%，分别提高了 32. 48%和36. 70%，之后随压力增加迅速下降；
[0044] 4. 2不同保压时间对酶活力及酶解产物水解度的影响
[0045] 不同保压时间处理的胃蛋白酶活力及对应处理组（图2中保压时间为Omin)酶解 酪蛋白的水解度变化情况见图2。在lOOMPa压力下，随保压时间的延长，胃蛋白酶活力及 酶解物的水解度均显著提高（P < 〇. 05)。故lOOMPa，10-20min的压力处理可显著改善胃 蛋白酶活力及该酶水解酪蛋白的能力。在保压15min时，酶活力及水解度分别从空白样的 12. 52X 104u、8. 23%提高到 21. 36X 104u、ll. 02%，分别提高了 29. 45%和 33. 90%。
【主权项】
1.本发明一种高压处理提高胃蛋白酶活力的方法，其特征在于： (1) 酶溶液的制备：称取定量胃蛋白酶溶于pHl. 5的盐酸溶液，使浓度达到2mg/mL，4°C 冷藏，lh内迅速完成高压处理。 (2) 高压处理：将制备的酶溶液经真空包装，随后置于高压处理设备中，于20°C下，进 行lOOMPa压力下保压10-20min的处理。 (3) 保存：将高压处理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
【专利摘要】本发明一种高压处理提高胃蛋白酶活力的方法。称取定量胃蛋白酶溶于pH？1.5的盐酸溶液，使浓度达到2mg/mL，4℃冷藏，1h内迅速完成高压处理。将制备的酶溶液经真空包装，随后置于高压处理设备中，于20℃下，进行100MPa压力下保压10-20min的处理。将高压处理后的胃蛋白酶溶液在1℃下冷藏保存。通过本发明的一种高压处理提高胃蛋白酶活力的方法，使胃蛋白酶活力提高了29％以上，胃蛋白酶活力显著提高，实现提高胃蛋白酶活力的目的。
【IPC分类】C12N9/48
【公开号】CN105316305
【申请号】CN201510827332
【发明人】马汉军, 刘本国, 康壮丽, 李斌, 白腾辉
【申请人】河南科技学院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月17日