一种抑制松针褐斑病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对松针褐斑病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 松针褐斑病是松树上最严重的病害之一，在美国主要危害长叶松和欧洲赤松，还 危害湿地松和火炬松。湿地松和火炬松是早期速生的重要用材树种，我国自1973年大面积 引种以来，南方各省普遍栽植，造林面积已超过150ha 2。1978年，在福建省顺昌县洋口林场 和沙县官庄林场的湿地松幼林中发现松针褐斑病，经鉴定，病原菌为松针褐斑病菌。该病害 发展十分迅猛，三年内就使数百公顷的湿地松幼林遭受毁灭性损失。在我国，该病害除危害 湿地松和火炬松外，还危害黑松扭等20多种松树。近年来，福建、江西、广东、广西、安徽、浙 江、湖南等省普遍发生。感病植株轻者生长受到影响，重者整株枯死。在发病严重地区还常 造成幼林成片毁灭，尤其在发病较重的福建西北部及广东、江西和安徽的某些地区，该病已 成为湿地松发展的一个重要障碍，该病对我国南方松林的发展造成严重制约。经过20多年 的系统研究，目前已经确定了松针褐斑病菌致病的主要因子是其产生的毒素。
[0003] 松针褐斑病菌是20世纪70年代后，在我国南方开始扩散蔓延的一种危害严重的 森林有害生物。一般认为是1974年由美国随种子材料传入的，但尚不能排除来自本地种源 的可能性。松树受害后，针叶大量枯黄，几乎全部脱落；植株感染后，轻者影响生长，重者整 株死亡。对经济效益高，无性繁殖容易的1~2年生五针松作砧木的嫁接小苗也能感病，致 使成活率极低，给花木的生产与推广造成极大障碍。松针褐斑病菌本身不携带其他有害生 物。松针褐斑病菌在国内各发生区均被作为重点防治对象进行治理，以减少病害造成的经 济损失。我国在1984年和1996年两次将其列入国内森林植物检疫对象名单。
[0004] 松针褐斑病菌以子实体和病斑组织中的菌丝体在树上病叶或落地病叶上越冬，发 病林分中全年可见活孢子存在，孢子借助雨水的溅落和风的作用在林内做有限距离的自然 传播，侵染在全年都可能发生。人为调运感病苗木或嫁接苗是其远距离传播的主要方式，病 菌在运输过程中的存活率较高且不易发现，一旦传入新的地区极易形成新的发病中心。在 地理环境、气候条件适宜地区，病菌的孢子在16~28°C条件下萌发良好，较高温湿度有利 于病菌的生长，但温度过高(月平均温度超过28°C)会抑制病菌的发展，由此推断该病菌在 我国南方亚热带地区和部分热带地区有较大的适生范围。松针褐斑病菌在国外分布于俄罗 斯、希腊、南斯拉夫、保加利亚、西班牙、奥地利、法国、德国、瑞士、加拿大、美国和哥伦比亚 等国家。
【发明内容】
[0005] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对松针褐斑病菌的生物活性。
[0006] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对松针褐斑病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得到 其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0007] 所述化合物结构特征如下图式所示：
【具体实施方式】
[0008] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0009] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0010] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加 1000 mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0011] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加 1000 mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0012] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0013] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50 μ L，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0014] 计算公式为：菌液浓度=nX20X 100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0015] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC (Minimal Inhibitory Concentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0016] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256以 8/11^，在96孔板上1~10行，每孔加10(^1^不同浓度的药液和10(^1^ 菌液，使最终菌液浓度为1~5 X 105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0017] 测得最小抑菌浓度MIC值为0· 5 μ g/mL。
[0018] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0019] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加 1000 mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0020] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加 1000 mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0021] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0022] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50 μ L，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X 100cfu/mL。
[0023] (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0024] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC (Minimal Bactericidal Concentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10 μ L溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0025] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256以 8/11^，在96孔板上1~10行，每孔加10(^1^不同浓度的药液和10(^1^ 菌液，使最终菌液浓度为l~5X10 5cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10 μ L接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0026] 测得最小杀菌浓度MBC值为2 μ g/mL。
【主权项】
1. 一种抑制松针褐斑病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下图式所示：(2) 其可作为松针褐斑病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对松针褐斑病菌的最小抑菌浓度MIC值为0. 5μg/mL; (4) 其对松针褐斑病菌的最小杀菌浓度MBC值为2μg/mL。
【专利摘要】本发明发现对松针褐斑病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其松针褐斑病菌的最小抑菌浓度MIC值为0.5μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为2μg/mL。
【IPC分类】A01P3/00, C07D413/04
【公开号】CN105384733
【申请号】CN201510730101
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月2日