一类Tetramic acid化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤、抗病毒药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一类Tetramic acid化合物及其制备方法和 在制备抗肿瘤、抗病毒药物中的应用。
【背景技术】
[0002] Tetramic acid(吡咯烷-2, 4-二酮）类的天然产物通常可以从细菌、真菌以及 海绵中分离得到[Schobert, R. ;Andrea, S. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 4203 - 4221.]。它 们的结构特征是含有1个吡咯-2, 4-二酮的杂环片段，很长的侧链或由很多环聚合在一起 等，其中含有十氢萘片段的tetramic acid类化合物经常在很多微生物的次生代谢产物中 被发现，由于tetramic acid类化合物具有结构新颖、活性独特的特点[Li，G. ;Kusari，S.; Spiteller, M. Nat. Prod. R印· 2014, 31，1175 - 1201.]，因此，很多学者们对它们的生物合 成、化学合成以及生物活性展开了广泛的研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个目的是提供一类具有抗肿瘤和抗病毒活性的Tetramic acid类化 合物。
[0004] 本发明通过多种柱层析及一维、二维核磁共振波谱，从真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的发酵液中分离得到一类新的Tetramic acid类化合物，这种化合物具有抑制 多种癌症细胞和HSV-I病毒生长的活性，可用于制备抗肿瘤和抗病毒药物，从而实现了本 发明的目的。
[0005] 本发明的5个Tetramic acid类化合物，其结构如式（I )和式（II )所示：
[0007] 其中，式（I )中
[0012] 或化合物3,其结构如式（II )所示。
[0013] 本发明的第二个目的是提供上述Tetramic acid类化合物的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤：
[0014] (1)制备真菌 Trichobotrys effuse DFFSCS021 的固体发酵物；
[0015] (2)将步骤⑴得到的固体发酵物的浸膏用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取， 浓缩得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；
[0016] ⑶将步骤⑵所述的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物经过中压、 常压硅胶柱层析，以水-甲醇、氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、石油醚-丙酮或 石油醚-乙酸乙酯溶剂系统分别作为正反相洗脱剂，从体积比100:0到0:100进行梯度洗 脱，用薄层层析追踪合并组分，经过Sephadex LH-20凝胶柱层析得到粗品，经高效液相色谱 纯化，得到Tetramic acid类化合物1-5。
[0017] 步骤（1)中所述的真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的固体发酵物是通过 将真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021接种到真菌适用的培养基中，在通常的发酵条件 下制得。优选的制备方法是将真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021接种于PDA琼脂培 养基中，28°C培养3天，得到培养有菌种的平板，然后将平板中菌种接种入液体培养基中， 于转速180r/min摇床、温度28°C培养3天，得到种子液，再将种子液接种于大米培养基中， 于28°C静置培养30天，得到固体发酵物，所述的液体培养基为每升含有葡萄糖10g，甘露醇 2〇g，麦芽糖20g，玉米浆lg，味精10g，KH 2PO4O. 5g，MgSO4O. 3g，酵母浸膏3g，海盐30g，余量 为水，pH 7. 0,所述的大米培养基为每600mL是这样配制的：将大米400g，酵母膏2g，葡萄糖 2g，海盐18g，加入到容器中，然后用水定容到600ml。
[0018] 本发明的第三个目的是提供真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021在制备上述 Tetramic acid类化合物中的应用。
[0019] 通过体外抗肿瘤活性筛选实验，结果显示：本发明的Tetramic acid类化合物能 抑制肝癌细胞株ifepG2、宫颈癌细胞株HeLa、食管癌细胞株Ecal09、前列腺癌细胞株PC-3、 喉癌细胞株H印-2、白血病细胞株KG-la、单纯疱疹病毒HSV-I的生长，它们的IC 5。值如表3 所示，由此证明本发明的Tetramic acid类化合物可以用于制备抗肿瘤和抗病毒的药物。
[0020] 因此，本发明的第三个目的是上述Tetramic acid类化合物在制备抗肿瘤或抗病 毒药物中的应用。
[0021] -种抗肿瘤或抗病毒药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成分的Tetramic acid类化合物和药学上可以接受的载体。
[0022] 所述的抗肿瘤药物优选为抗肝癌、宫颈癌、食管癌、前列腺癌、喉癌、白血病的药 物。
[0023] 所述的抗病毒药物优选为抗单纯疱疹病毒HSV-I的药物。
[0024] 本发明的Tetramic acid类化合物对人肝癌细胞株HepG2、宫颈癌细胞株HeLa、食 管癌细胞株Ecal09、前列腺癌细胞株PC-3、喉癌细胞株H印-2、白血病细胞株KG-la、单纯疱 疹病毒HSV-I的生长有较强的抑制作用，在制备抗肿瘤和抗病毒药物方面有良好的应用前 景。
[0025] 本发明的真菌 Trichobotrys effuse DFFSCS021 于 2015 年 8 月 20 日保藏于 中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号：CCTCC NO. M 2015496。
【附图说明】：
[0026] 图1是化合物1中的关键HMBC和1H-1H COSY图；
[0027] 图2是化合物1中的关键NOESY图；
[0028] 图3是化合物1-5的⑶图。
【具体实施方式】：
[0029] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0030] 实施例1 :Tetramic acid类化合物1-5的制备
[0031] 每升液体培养基是这样配制的：将10克葡萄糖，20克甘露醇，20克麦芽糖，1克玉 米浆，10克味精，0. 5克KH2PO4,0. 3克MgSO4, 3克酵母浸膏，30克海盐混合，用水定容到1L， 调pH 7. 0。将液体培养基装入约5个500mL的三角烧瓶中，每瓶约150mL，在121°C高压蒸 汽灭菌25分钟。
[0032] 大米培养基是这样配制的：每个5L三角瓶中盛装大米400g，酵母膏2g，葡萄糖 2g，海盐18g，用水定容到600mL，混匀，121°C高压蒸汽灭菌25分钟，共6瓶备用。
[0033] 用移液枪吸约2微升的真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021菌种接种入PDA琼 脂培养基上，28°C培养3天，得到培养有菌种的平板，然后用竹签从平板中挑约3微升菌种 接种入含150mL上述液体培养基的500mL三角烧瓶中，于摇床（转速180r/min)温度28°C 培养3天，得到种子液后，在上述盛有大米培养基的5L三角瓶中接种50mL种子液，于28°C 静置培养30天后，收取固体发酵物。
[0034] 将经大米培养基培养得到的固体发酵物每瓶用2L丙酮浸泡、捣碎，在用组织匀浆 机搅拌均匀，超声破壁30分钟，减压抽滤得到滤液，将滤液减压蒸馏除去丙酮后，再用水制 成水混悬液，再用20L乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物29. 93g。乙酸乙酯提 取物用正相硅胶（200-300目）干法拌样后，装入玻璃层析柱（含正相硅胶200-300目约 300g)，进行常温柱层析，以氯仿-甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0到0:100进行梯度洗 脱，根据薄层层析（GF 254硅胶板）情况合并得到7个流分（Fr. I-Fr. 7)，回收洗脱溶剂，蒸 干流分用甲醇转移。在薄层层析板能用氯仿-甲醇（体积比10:1)为展开剂展开的流分 Fr. 2进一步通过硅胶柱（含正相硅胶100-200目约100g)进行常温柱层析，以石油醚-氯 仿作为洗脱剂，从体积比100:2到0:100进行梯度洗脱，根据薄层层析（GF254硅胶板）情况 合并得到3个亚流分（Fr. 2-1-Fr. 2-3)，其中在薄层层析板上用氯仿-甲醇（体积比10:1) 为展开剂时，含Rf值为〇. 5~0. 7主点的亚流分Fr. 2-1采用高效液相半制备（检测波长 为254nm，流速为3mL/min，色谱柱为YMC-Pack 10_X 250_，流动相为体积比为85:15的 甲醇-水）分别在出峰时间为30和39分钟时分离纯化得到化合物4和5。其中在薄层层 析板上用氯仿-甲醇（体积比10:1)为展开剂时，含Rf值为〇. 2~0. 5主点的流分Fr. 3 进一步通过硅胶柱进行常温柱层析，以氯仿-丙酮作为洗脱剂，从体积比100:2到1:1进行 梯度洗脱，根据薄层层析（GF 254硅胶板）情况合并得到4个亚流分（Fr. 3-1-Fr. 3-4)，其中 在薄层层析板上用氯仿-甲醇（体积比10:1)为展开剂时，含Rf值为0. 3~0. 5主点的亚 流分Fr. 34再通过中压柱层析，以甲醇-水作为洗脱剂，从体积比2:8到9:1进行梯度洗 脱，根据薄层层析（GF254硅胶板）情况合并得到4个亚流分（Fr. 3-1-1-Fr. 3-1-4)，其中在 薄层层析板上用氯仿-甲醇（体积比10:1)为展开剂时，以Rf值为0. 3~0. 5主点为主要 成分的亚流分Fr. 3-1-1采用高效液相半制备（检测波长为254nm，流速为3mL/min，色谱柱 为YMC-Pack 10mmX250mm，流动相为体积比为60:40的甲醇-水）分别在出峰时间为16、 19和22分钟时分离纯化得到化合物3、1和2。
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