6] (1)目的片段的回收
[0067] 采用煮沸法。具体操作为：先从胶上将目标条带挖下来装入1. 5mL的Eppendorf 管内，向管内加入100μL超纯水，加水量视胶带颜色深浅而定；常温下浸泡24h，转入95°C 水浴锅（或PCR仪）中煮30min后，5000rpm离心3min。产物即可取上清3μL做模板进行 PCR扩增，剩余产物置-20°C保存备用。
[0068] (2)目的片段的纯化
[0069] 用PCR产物直接纯化方法。在PCR产物中加入2倍体积的无水乙醇，_20°C过夜放 置，1，2000rpm离心5min就可以得到纯化产物。
[0070] (3)目的片段与载体的连接
[0071]反应体系为10μL:PMD18-TVectorl. 0μL;LigationbufferI5.0μL;目的片 段4.0μL。
[0072] 在超净工作台上加样，混匀反应物，短暂离心，16°C连接约lh，过夜也不影响连接 效率。
[0073] (4)连接产物的转化
[0074] 1)取出感受态细胞，SolutionA，SolutionB，置于冰上融化；
[0075] 2)感受态（50μL) +5μLSolutionA+4μLSolutionB+46μL预冷去离子水；
[0076] 3)用冷却的无菌枪头将上述悬浮液分装到1. 5mL离心管，每管加入105μL，再加 入5μL的目的DNA，轻旋混匀；
[0077] 4) 42°C水浴热激90s，注意不要晃动离心管；
[0078] 5)快速将管转移到冰浴器中，使细胞冷却3~5min;
[0079] 6)加入500μLLB液体培养基。在37°C，150rpm摇床上预培养lh;
[0080] 7)将菌液涂布到含有 100μg.mL11^、25μg.mL4PTG和 40μg.mLl-GAL的LB 固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻的将菌液均匀涂开，置于室温直至液体被吸收；
[0081]8)倒置平板，37°C培养12~16h。
[0082] (5)重组质粒的蓝白斑筛选
[0083] 经37°C培养后，在涂布X-Gal/IPTG的LB平板上出现少量蓝色菌落和较多的白色 菌落，其中白色菌落为重组克隆子。挑取白色单菌落涂抹在划好方格的LB液体培养基中， 37°C，150rpm过夜培养。
[0084](6)菌落PCR的检测
[0085] 吸取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。取4μLPCR产物，经1. 5 %琼脂糖
[0086] 凝胶电泳检测，与PCRMarker标准分子量相比较检测插入片段的大小，与插入目 的片段大小一致的克隆即为阳性克隆。
[0087] (7)克隆后载体的测序与分析
[0088] 取3个阳性克隆菌液在甘油（330μL甘油中加入1000μL菌液）中各保存两份， 一份-20°C保藏，一份送去测序。
[0089] 其中Indelpe02标记引物Indelpe02-F/Indelpe02-R扩增出的与黄瓜果实栅栏状 表皮细胞基因Pe连锁的特征片段的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；与黄瓜果实扁平状表 皮细胞基因pe连锁的特征片段的核苷酸序SeqIDNo.2所示。
[0090] 实施例2.本发明所述试剂盒及其制备方法
[0091] 将实施例1获得的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的所述Indel标 记Indelpe02的引物组装成试剂盒，所述试剂盒可用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因 Pe的黄瓜材料。所述Indel标记Indelpe02的上下游引物的核苷酸序列分别如SeqIDNo. 3 和SeqIDNo. 4所示。进一步地，还可将进行PCR反应和/或电泳所需的试剂与所述引物 一起组装成所述试剂盒。
[0092] 进一步地，所述试剂盒的制备方法包括：将所述Indel标记Indelpe02的引物和/ 或进行PCR反应和/或电泳所需的试剂组装成试剂盒；或
[0093] 将所述Indel标记Indelpe02的引物和/或进行PCR反应和/或电泳所需的试剂 装入标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因Pe的黄瓜材料的用途的包装内；
[0094] 所述所述Indel标记Indelpe02的上下游引物的核苷酸序列分别如SeqIDNo. 3 和SeqIDNo. 4 所示。
[0095] 实施例3.与黄瓜Pe基因连锁的Indelpe02标记的验证
[0096] 采用实施例1获得的与Pe基因连锁的所述Indel标记Indelpe02的引物，或者采 用实施例2所述的试剂盒对回交群体BC^、BCiP2分别为79和69个单株的群体进行验证， 以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。验证采用实施例1中步骤2中的PCR扩增 和检测方法。
[0097] 结果发现，在这BC^群体中有72个株系的带型的表型与田间调查结构一致；在 Β(^Ρ2群体中，有69个株系的带型的表型与田间调查结构一致，计算准确率分别为91. 14% 和100%，见图1。
【主权项】
1. 一种与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因 Pe紧密连锁的Indel标记Indelpe02的引物， 其特征在于：具有如下核苷酸序列： Indelpe02-F/Indelpe02-R ： TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG 所述引物扩增的与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因 Pe连锁的特征条带为125bp，其核苷 酸序列如Seq ID No. 1所示； 所述引物扩增的与黄瓜果实扁平状表皮细胞基因 Pe连锁的特征条带为130bp，其核苷 酸序列如Seq ID No. 2所示。2. 用于筛选包含果实栅栏状表皮细胞基因 Pe的黄瓜材料的试剂盒，其特征在于，包括 权利要求1所述的Indel标记Indelpe02的引物。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或 电泳所需的试剂。4. 用于筛选具有果实栅栏状表皮细胞基因 Pe的黄瓜材料的方法，其特征在于，采用权 利要求1所述的Indel标记Indelpe02的引物和/或权利要求2或3所述的试剂盒进行如 下步骤： (1) 采用所述Indel标记Indelpe02的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA进行PCR扩 增； (2) 对扩增结果进行凝胶电泳检测； (3) 从检测结果中筛选出现与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因 Pe连锁的Indel标记特 征条带一致的材料，所述与黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因 Pe连锁的Indel标记特征条带为 125bp，其核苷酸序列如Seq ID No. 1所示。5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述PCR扩增的反应体系为：I. 5ng/ μ I DNA模 板，所述引物正向和反向各5ng/μ 1，0· 5 μ 1/μ I Go Taqj? Green Master Mix，其余为双蒸 水。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其中，所述PCR扩增的反应程序为：94°C预变性4 分钟；94°C变性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35个循环；72°C保温5分钟，16°C保 存。7. 根据权利要求4所述的应用，其中所述凝胶电泳检测指，采用6%的非变性聚丙烯酰 胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。8. 权利要求2或3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中包括权 利要求1所述的Indel标记Indelpe02的引物，或 在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因 Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有权利要求 1所述的Indel标记Indelpe02的引物。9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，组装试剂盒的试剂中还包括PCR反应 和/或电泳所需的试剂，或 在标有筛选含果实栅栏状表皮细胞基因 Pe的黄瓜材料的用途的包装内装有PCR反应 和/或电泳所需的试剂。
【专利摘要】本发明“黄瓜果实栅栏状表皮细胞基因Pe的Indel标记及其应用”，涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜栅栏状表皮细胞基因Pe紧密连锁的Indel标记，其中所述标记引物的核苷酸序列为：Indelpe02-F/Indelpe02-R:TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG；所述Indel标记扩增的与黄瓜栅栏状表皮细胞基因Pe连锁的特征条带为125bp，核苷酸序列见Seq？ID？No.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜扁平状表皮细胞基因pe连锁的特征条带为130bp，核苷酸序列见Seq？ID？No.2；采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断其表皮细胞结构为栅栏状还是扁平状，该标记具有高效、限制少的优点，对选育果实具有栅栏状表皮细胞的加工型黄瓜材料提高了效率，缩短了育种周期。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105420235
【申请号】CN201510953053
【发明人】张圣平, 顾兴芳, 苗晗, 张松, 王烨
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月17日