后并质朴检测，根 据分子量定量分析，图中的三个虚线分别标记为原始延伸引物(M.W=5084Da)、突变延伸产 物(M.W=5356Da)、野生延伸产物的分子量(M.W=5412Da)，而在图中在延伸引物、突变延伸 产物处存在有质谱峰，即可判定延伸的碱基为ddATP，检测出SNP位点发生突变，由碱基T突 变为A。 以上所述仅为本发明的较佳实施例，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和 范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等同替换。另外，在本发明的教导 下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神 和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范 围内的实施例都属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种自动进行固相PCR反应的微流工作站，所述工作站包括： 至少一个微流控芯片，芯片含有一个或多个独立的反应通道，每一反应通道包括进出 口、一个或多个串联或并联的反应腔室和/或流道，反应腔室底面锚定有寡核苷酸序列，以 进行固相PCR扩增和/或固相单碱基延伸反应； 液路系统，以控制引入不同反应试剂溶液流至对应的反应腔室； 温控装置，以控制调节所述反应腔室内的温度； 控制系统，其连接上述液路系统和温控装置，用于控制液路系统和温控装置，在微流控 芯片的反应腔室内进行的固相PCR扩增和固相单碱基延伸反应，并包括变性-洗脱反应和洗 脱-变性反应。2. 根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片包括上盖、反应通 道和基底，上盖设有反应通道的进出口，基底进行刻蚀挖槽成反应通道，通道长度为2-8cm， 深度为50um-200um，宽度为0 · 5mm~3mm，单个反应通道的反应体系总体积为5ul~20ul 〇3. 根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片包括上盖、通道栅 栏和基底，上盖设有反应通道的进出口，上盖-通道栅栏-基底的"三明治结构"形成多个独 立的反应通道。4. 根据权利要求2和3所述的微流控芯片，其特征在于，通过对分层结构的键合封装，形 成可进出流通的封闭反应腔室。5. 根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片材质为包括金属、 玻璃、硅片和聚合物的至少一种或组合组成，其容纳流体的有效结构至少在一个维度上为 微米级尺度，微流控芯片处于多个的状态下，各个微流控芯片分别独立与控制系统连接。6. 根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片的固相衬底为平面 结构，可锚定高密度的一种或多种寡核苷酸序列，所述固相衬底平铺锚定寡核苷酸序列是 通过羧基/醛基/环氧基-氨基、链霉亲和素-生物素在内的多种化学修饰中的至少一种完 成。7. 根据权利要求6所述的微流工作站，其特征在于，所述锚定在芯片通道底面的寡核苷 酸序列是PCR扩增所需的反向引物。8. 根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述的固相单碱基延伸反应包括发 生一个或多个退火-延伸反应。9. 根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述温控装置设置在芯片反应腔室 的底面。10. 根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述液路系统包括设置各种所述 试剂的容器、与反应通道相连的通路及控制阀，所述试剂包括用于PCR扩增的正向引物/单 碱基延伸引物、脱氧核糖核苷三磷酸/双脱氧核糖核苷三磷酸、反应酶、反应缓冲液和清洗 缓冲液在内，控制系统与此控制阀相连接，以控制阀门的开关或通路流量的大小。11. 根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述控制系统包括电力提供装置、 控制器、采集器、显示装置和/或输出装置，电力提供装置给微流工作站提供电力，控制器连 接采集器，显示装置和/或输出装置，并连接液路系统和温控装置。12. -种基于权利要求1所述的基于微流控芯片实现固相PCR反应的方法，其特征在于， 包括以下步骤： A:在微流控芯片的每一反应通道的固相衬底上发生固相PCR扩增反应； B:在经过变性处理及洗脱后，目标单链DNA片段固定在固相衬底； C:进行固相单碱基延伸反应，并对延伸产物进行提纯分离。13. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤A进一步包括： 控制系统将含有PCR反应液、dNTP、DNA模板/全血、正向引物在内的混合液由液路系统 引入固相衬底锚定连接有反向引物的反应腔室， 控制系统控制温控系统在经过若干次的变性、退火、延伸后生成含有反向引物的目标 单链DNA和含有正向引物的互补单链DNA，两条单链DNA可互补生成双链DNA，并通过反向引 物固定在通道底面。14. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤B进一步包括： 变性处理，控制系统控制液路系统引入碱性溶液到反应腔室内进行化学变性，或控制 温控系统加热进行热变性包括控制系统控制反应通道内的化学方式或热处理，双链DNA发 生变性解链，互补单链DNA发生游离； 控制系统引入清洗缓冲液对反应通道进行反复的清洗，洗脱掉游离物至废液仓，对锚 定在固相衬底的目标单链DNA进行提纯。15. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤C进一步包括： 控制系统将含有PCR反应液、ddNTP、单碱基延伸引物在内的混合液引入到反应腔室， 通过温控系统进行一次或多次退火-延伸后，单碱基延伸引物杂交到目标单链DNA，延 伸一个碱基即终止，且锚定在固相衬底； 再次引入清洗缓冲液对通道进行反复清洗，洗脱掉未反应延伸引物、ddNTP在内的物 质，实现对错定在固相衬底的目标单链DNA和延伸广物进彳丁提纯， 最后引入去离子水对反应通道进行反复清洗去盐处理，并通过温控系统进行加热变性 处理，延伸产物发生解链游离，回收含有游离延伸产物的去离子水，并含有游离延伸产物的 去离子水引入至产物仓。16. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，PCR扩增的正向引物和锚定在芯片通道 底面的反向引物在固相PCR扩增过程中，反复进行变性-退火-延伸反应，生成双链DNA且锚 定在芯片通道底面。17. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，单碱基延伸引物可与锚定在芯片通道底 面的反向引物延伸的目标单链DNA发生退火互补杂合。18. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，ddNTP仅用于固相单碱基延伸反应，在延 伸引物下游仅发生一个碱基的延伸。19. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述变性-洗脱反应，变性反应使锚定在 芯片通道底面的双链DNA发生变性，解链为目标单链DNA和互补单链DNA，互补单链DNA发生 游离;洗脱将游离的互补单链DNA、未反应的正向引物、dNTP在内的物质清洗掉，对锚定在芯 片通道底面的目标单链DNA进行提纯。20. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述洗脱-变性反应，洗脱将未反应的单 碱基延伸引物及ddNTP在内的物质清洗掉，对锚定在芯片通道底面的目标单链DNA和延伸产 物进行提纯;变性反应使延伸产物与目标单链DNA解链，延伸产物发生游离。
【专利摘要】本发明公开了一种进行固相PCR反应的自动化微流工作站及方法，该方法为基于微流控芯片实现固相PCR反应的方法。该工作站包括：至少一个微流控芯片，芯片含有一个或多个独立的反应通道，每一反应通道包括进出口、一个或多个串联或并联的反应腔室和/或流道，反应腔室底面锚定有寡核苷酸序列，以进行固相PCR扩增和/或固相单碱基延伸反应；液路系统，以控制引入不同反应试剂溶液流至对应的反应腔室；温控装置，以控制调节所述反应腔室内的温度；控制系统，其连接上述液路系统和温控装置，用于控制液路系统和温控装置，在微流控芯片的反应腔室内进行的固相PCR扩增和/或固相单碱基延伸反应，并包括变性-洗脱反应和洗脱-变性反应。该工作站具有一站式自动化、较高通量、低成本、操作方便、快速高效、准确性高的优点。
【IPC分类】C12M1/38, C12N15/10
【公开号】CN105505766
【申请号】CN201610061168
【发明人】张一桐, 李鹏鑫, 张祥林, 胡秋萍, 于丹, 陈勇
【申请人】上海美吉逾华生物医药科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月28日