一种进行固相pcr反应的自动化微流工作站及方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种基于微流控芯片的固相PCR&单碱基延伸 反应，对接核酸质谱检测，主要应用于单核苷酸多态性检测，尤其是一种适用于一站式自动 化、多样本、高通量、快反应、低成本的SNP检测样本前处理，可与核酸质谱检测仪如MALDI-T0F-MS直接对接，进行SNP位点检测。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)是指个体基因组内 特定核苷酸位置上的单个碱基A，T，C，G的改变而引起的DNA序列的改变或突变，这种突变包 括单碱基的转换、颠换、插入或缺失等。严格来说，只有当等位基因的频率大于或等于1%时 才能称得上是SNPs，然而部分SNPs数据库如HGVBase把等位基因的频率小于1 %的变异也包 括在SNPs内。研究表明，人类每对等位染色体上每lOOObp就会出现1个SNP，而整个人类基因 组每300bp就会出现1个SNP，在任意两个个体之间，就有好几百万的单碱基差异和十万个氨 基酸的不同，在一定程度上反映了人类个体或群体的特异性，也造成人类在内的物种之间 染色体基因组的多样性。
[0003] 对人类基因组的SNP进行大规模的研究具有重要的意义，它不仅可以研究人类的 起源、进化和群体遗传学特征，而且为多基因病和复杂性疾病如人类肿瘤、糖尿病、心血管 疾病、自身免疫性疾病、精神病、老年性痴呆等相关基因的研究和药物遗传学的研究提供了 科学基础和先进手段。SNP检测是目前基因诊断的主要研究内容。同时，SNP检测所代表的基 因诊断也逐渐成为新生儿或特定人群遗传病筛查的重要手段之一。
[0004] 由于SNP其重要性，并且随着SNP研究的普及和深入，SNP的检测方法目前已有了长 远的发展，如全基因组测序，外显子组测序，全基因组SNP芯片，质谱法，SNPseq法，SNPlex， SNaPshot等，都可以快速、高效、较大通量检测基因组中的SNP，但这些设备价格昂贵，仅适 用于大型实验室的研究，难以在普通实验室进行普及。
[0005] 质谱法是SNP位点检测的常用方法和最具前景的技术。质谱法是通过对物质的分 子量(质荷比）进行检测，达到区分、鉴别物质的目的。SNP位点两个等位基因之间存在分子 量差异，通过分型实验将差异放大，然后以质谱仪进行检测即可达到SNP分型的目的。其主 要是在紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP， dideoxy-nucleoside triphosphate)替代dNTP脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP，deoxy-nucleotide thiophosphate))，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点 的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪可以检测出这种微小的 分子量差异，从而实现SNP分型的目的。
[0006] 其中，MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统由专业生产生物芯片系统用于遗传 突变及SNP领域研究的美国Sequenom公司开发，是目前采用质谱法直接检测SNP的成熟设 备。该系统的突出特点是能以极高的精确度进行基因型识别，直接测出带有SNP或其他突变 的目标DNA。由于质谱法直接检测分子的本质特征-分子量，不需要通过荧光标记来进行间 接检测，准确可靠；灵敏度高，可检测低至lOng的核酸片段。然而，国外公司利用质谱仪对 SNPs位点进行检测的方法，在样本前处理过程中存在不少缺陷。如Sequenom的标准流程采 用的是两步PCR:普通PCR预扩增和单碱基延伸PCR扩增，即放大含待检测SNP位点的ssDNA模 板和放大含SNP位点的延伸产物;PCR预扩增需要45个循环，单碱基延伸循环需要40个外循 环且每个外循环又内嵌5个内循环反应;且在两次PCR扩增之间，还需要使用虾碱性磷酸酶 (Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)消化除去第一次PCR反应体系中剩余的dNTP和引物； 这样就造成样本处理时间的延长、试剂消耗及检测成本的增加，尤其整个流程操作需要长 达10个小时左右，不利于样本的即时检测。
[0007] 微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基 本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程;其是生命科学、化学科学 与信息科学信号检测和处理方法研究的重要技术平台。近十年来，微流控芯片技术在生物、 医学、临床等领域得到了快速发展，尤其是核酸的扩增及分析等（Zhang Y，0zdemir P.Analytica chimica acta,2009,638(2):115-125；Horsman K M,Bienvenue J M, Blasier K R.Journal of forensic sciences,2007,52(4):784-799.)〇
[0008] 在PCT号为PCT/US2012/056888中林巧、朱静等人公开了一种核酸在微芯片上的分 离和富集的方法:基于微流控芯片，以反应微室中的磁珠为载体实现固相PCR扩增及单碱基 延伸反应，以检测SNPs及分离和富集所需DNA分子。但其微芯片集成微加热器和温度传感 器，以磁珠为反应载体，若涉及不同样本和不同SNP位点检测，则需更换磁珠或其表面锚定 的引物，这样就造成反应过程中的操作繁琐，且难以实现反应的自动化处理。
[0009] 综上所述，现有的实现SNP位点检测方法，存在以下问题:样本处理操作步骤繁琐， 所需配备仪器设备较多且昂贵，人工操作带来的干扰性大，且整个实验耗时较长，难于实现 临床中的即时检测。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是为了提供一种基于微流控芯片作为反应通道和固相载体，并利用 固相PCR扩增方法和固相单碱基延伸方法，在功能集成的微流工作站中，进行SNP检测样本 前处理，能够和核酸质谱检测分析仪直接对接，检测出SNP位点。该工作站基于微流控芯片 通道底面作为固相衬底锚定连接反向引物，并进行固相PCR扩增反应、变性-洗脱反应、一步 单碱基延伸反应和洗脱-变性反应:克服现有质谱法检测SNP样本处理过程中需对样本进行 两次多循环PCR扩增反应、SAP消化处理而导致的成本高、耗时、费力等缺陷;借助集液路系 统、温控装置和控制系统等于一体的微流工作站实现反应的一站式自动化操作；同时一次 性用的芯片避免样本间的交叉污染，并可根据不同SNP位点和检测需求量，使用不同类型芯 片和不同寡核苷酸序列;在工作站对样本进行处理后，可直接对接核酸质谱分析仪;该工作 站具有一站式自动化、较高通量、低成本、操作方便、快速高效、准确性高等优点。
[0011] 在本文的各个方面，本发明包括可用于对一个或多个样本，包括全血或DNA样本， 进行固相PCR扩增&单碱基延伸反应的微流工作站，其包括微流控芯片、液路系统、温控装置 和控制系统等。其中，微流控芯片，提供反应通道和固相衬底:所有反应在一个或多个串联 的反应腔室或流道完成，通道底面的固相衬底平铺锚定有反向引物，在固相衬底上可进行 固相PCR扩增和固相单碱基延伸反应;液路系统，连接微流控芯片，在反应过程中，则用于在 特定时间和环境下控制引入特定的反应试剂溶液至反应腔室，与反向引物或目标DNA片段 接触反应;温控装置，紧贴芯片通道底面，主要为帕尔贴加热片或其他加热/冷却装置，在反 应过程中为通道底面和反应溶液试剂提供特定的温度环境;控制系统，耦连液路系统和温 控装置，为用户可操作系统:可设置输入相关信息参数，包括反应温度、反应时间、试剂流速 等，并以此对控制系统和温控装置进行监测并反馈输出指令集，使系统反应能按照设定参 数自动完成。
[0012] 在实施例中，微流控芯片材质为金属、玻璃、娃片和聚合物的一种或组合;微流控 芯片包括进出口和通道，其中芯片可为一个或多个并行的通道，每个通道可为一个或多个 串行的反应腔室或流道，通道底面为平面状或有阵列凹池，锚定连接一种或多种反向引物； 通道底面-反向引物的连接方