。用Smart-Seq2和SMARTer?进行所有成对比较，并且 报告为平均数和90%的置信区间。（D)(C)中基因表达估测值的标准差。(E)平行细胞中可重 复检测的基因的百分比。用Quartz-seq进行所有成对比较，并且报告为平均数和90%的置 信区间。(F)(E)中基因表达估测值的标准差。
[0025]图7示出使用SMARTer、优化的Smart-Seq以及优化方案的变体产生的单细胞文库 的映射统计。（A)对于每个单细胞RNA-Seq文库，具有1至9个错配的唯一比对读段(uniquely a 1 inged reads)的分数。（B)唯一比对、比对到多个基因组坐标、或不比对到所有单细胞 RNA-Seq文库的读段的百分比。（C)映射到外显子、内含子或基因间区域的唯一比对读段的 分数。(D)每个细胞和文库制备方案的测序读段的数目。
[0026] 图8示出单细胞RNA-Seq方案中的基因表达和GC水平。
[0027]图9示出单细胞RNA-Seq灵敏度和变异性。（A)平行细胞中可重复检测的基因的百 分比。（B)基因表达估测值中的标准差。
[0028]图10示出单细胞RNA-Seq数据中的在整个基因上的读段覆盖度。
[0029] 图11示出在整个转录物上的读段覆盖度。(A)所有基因的读段覆盖度的平均分数。 (B) -(F)通过长度分组成5个相等大小的框的转录物。
[0030] 图12示出单细胞RNA-Seq数据中的读段峰。（A)每个单细胞RNA-Seq文库具有一个 或多个高密度峰的基因的数目。（B)在最高数目的文库中具有峰的整个基因的读段密度的 热图。
[0031] 图13示出使用Smart-Seq2的单细胞转录组学的技术和生物学变异性的评估。（A) 在HEK细胞的稀释液中可重复检测的基因的百分比。（B)(A)中基因表达估测值的标准差。 (C) 在HEK总RNA的稀释液中可重复检测的基因的百分比。（D)(D)中基因表达估测值的标准 差。(E)具有个体细胞的成对比较的(D)的基因表达估测值的标准差。
[0032] 图14示出用商用Tn5(Nextera公司（Nextera))产生的文库与用内部制备的Tn5产 生的文库的比较。(Α)使用内部条件可重复检测的基因的百分比。（Β)(Α)中基因表达估测值 的标准差。（C)使用商用缓冲液和条件可重复检测的基因的百分比。(D)(D)中基因表达估测 值的标准差。(E)在(A)中进行的反应的差异。
【具体实施方式】
[0033]本申请披露了用于以改善的逆转录、模板转换以及预扩增进行cDNA合成以增加由 个体细胞产生的cDNA文库的收率和平均长度的方法。
[0034]在一个实施例中，本发明提供一种用于制备与RNA分子互补的DNA的方法，包括以 下步骤：
[0035] 使cDNA合成引物退火于该RNA分子并且合成第一 cDNA链以形成RNA-cDNA中间体； 并且
[0036]通过使该RNA-cDNA中间体与模板转换寡核苷酸(TS0)在适于与该RNA分子互补的 该第一 DNA链延伸的条件下接触进行逆转录酶反应，从而使该第一 DNA链另外与该TS0互补， 其中该TS0在其3'末端包含锁核酸(LNA)。
[0037]在本发明的另一个实施例中，该逆转录反应在甲基基团供体和金属盐的存在下进 行。
[0038]在本发明的另一个实施例中，该甲基基团供体是甜菜碱。
[0039]在本发明的另一个实施例中，该金属盐是镁盐。
[0040] 在本发明的另一个实施例中，该镁盐具有至少7mM、至少8mM或至少9mM的浓度。
[0041] 在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸任选地包含一个或两个核糖核 苷酸残基。
[0042] 在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸包含至少一个或两个核糖核苷 酸残基和一个LNA残基。
[0043] 在本发明的另一个实施例中，该至少一个或两个核糖核苷酸残基是核糖鸟嘌呤。
[0044] 在本发明的另一个实施例中，该锁核酸残基选自下组，该组由以下各项组成:锁鸟 嘌呤、锁腺嘌呤、锁尿嘧啶、锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶以及锁5_甲基胞嘧啶。
[0045] 在本发明的另一个实施例中，该锁核酸残基是锁鸟嘌呤。
[0046] 在本发明的另一个实施例中，该锁核酸残基处于3'最末端位置。
[0047] 在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸在3'端包含两个核糖核苷酸残 基以及由式rGrG+N表征的一个锁核苷酸残基，其中+N表示一个锁核苷酸残基。
[0048] 在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸包含rCrG+G。
[0049] 在本发明的另一个实施例中，该甲基基团供体是甜菜碱，并且该金属盐是浓度为 至少9mM的MgCl2。
[0050] 在本发明的另一个实施例中，该方法进一步包括使用寡核苷酸引物扩增与RNA分 子和模板转换寡核苷酸互补的DNA链。
[0051] 在本发明的另一个实施例中，该模板转换寡核苷酸选自表S2中的这些寡核苷酸。 [0052]在本发明的另一个实施例中，该cDNA合成引物是一种oligo-dT引物。
[0053]在本发明的另一个实施例中，该cDNA是在包括锚定的oligo-dT引物的珠粒上合成 的。
[0054] 在本发明的另一个实施例中，该0lig0-dT引物包含V -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3'的序列，其中"N"是任何核苷碱基，并且"V"选自下组， 该组由以下各项组成："A"、Τ'以及"G"。
[0055] 在本发明的另一个实施例中，该方法进一步包括PCR预扩增、标签化、以及最终PCR 扩增。
[0056] 在本发明的另一个实施例中，该PCR预扩增在未纯化从逆转录反应获得的cDNA的 情况下进行。
[0057] 在本发明的另一个实施例中，该RNA是细胞中的总RNA。
[0058] 在另一个实施例中，本发明提供了一种通过根据在此披露的任一实施例所述的方 法产生的cDNA文库。
[0059] 在另一个实施例中，本发明提供了通过根据在此披露的任一实施例所述的方法产 生的cDNA文库用于单细胞转录组概况分析的用途。
[0060] 在另一个实施例中，本发明提供了一种用于分析多个单细胞中的基因表达的方 法，该方法包括以下步骤:制备通过根据在此披露的任一实施例所述的方法产生的cDNA文 库;并且对该cDNA文库进行测序。
[0061] 在另一个实施例中，本发明提供了一种在3'端包含锁核苷酸残基的模板转换寡核 苷酸(TS0)。本发明的这些TS0可用于cDNA的合成以提高收率和长度。
[0062]在另一个实施例中，该TS0在:^端包含三个核苷酸残基，其中所述三个核苷酸残基 选自下组，该组由以下各项组成:+N+N+N、N+N+N、NN+N、rN+N+N、以及rNrN+N，其中N在每次出 现时独立地为脱氧核糖核苷酸残基，rN在每次出现时独立地为核糖核苷酸残基，并且+N在 每次出现时独立地为锁核苷酸残基。
[0063]在一个实施例中，该TS0处于:^端的这三个核苷酸残基的5M则的部分(在此也称为 5'部分)包含由核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其混合物构成的任意核苷酸序列。在一个 优选实施例中，该TS0的5'部分包含所有核糖核苷酸。在另一个优选实施例中，该TS0的5'部 分包含所有脱氧核糖核苷酸。
[0064]在另一个实施例中，这些TS0中的锁核苷酸残基选自下组，该组由以下各项组成： 锁鸟嘌呤、锁腺嘌呤、锁尿嘧啶、锁胸腺嘧啶、锁胞嘧啶、以及锁5-甲基胞嘧啶。
[0065] 在另一个实施例中，这些TS0的3'端的三个核苷酸残基是NN+G或rNrN+G，其中N在 每次出现时独立地为脱氧核糖核苷酸残基，并且rN在每次出现时独立地为核糖核苷酸残 基。
[0066]在另一个实施例中，这些TS0的3'端的三个核苷酸残基是rGrG+N，其中+N是锁核苷 酸残基。
[0067] 在另一个实施例中，这些TS0的3'端的三个核苷酸残基是rGrG+G。
[0068] 这些TS0优选地具有从约10至约50个核苷酸、或从约15至约45个核苷酸、或从约20 至约40个核苷酸、或从约24至约35个核苷酸、或约30个核苷酸的长度。
[0069] 在另一个实施例中，本发明提供了根据在此披露的实施例中任一个所述的TS0在 cDNA合成中的用途。
[0070] 适用于本发明的金属阳离子的例子包括但不限于Mg2+和Mn2+，优选Mg2+;并且它们 的浓度可在0_30μΜ的范围内，优选范围是3-20μΜ、更优选的范围是9-12μΜ。
[0071 ]除甲基供体甜菜碱之外，可在本发明的cDNA合成中添加的其他添加剂包括但不限 于海藻糖、鹿糖、葡萄糖、麦芽糖、DMS0(二甲亚砜）、甲酰胺、非离子型洗涤剂、TMAC(氯化四 甲基铵）、7_脱氮U兑氧鸟苷(dC 7GTP)、牛血清白蛋白（BSA)、以及T4基因32蛋白。
[0072]本发明适用于使用MMLV相关且具有模板转换活性的所有逆转录酶的反应。MMLV相 关的逆转录酶包括野生型莫洛尼氏鼠白血病病毒及其变体，包括例如缺乏RNA酶Η活性的衍 生物，诸如SUPER-SCRIPT II(英杰（Invitrogen))、P0TCR SCRIPT(BD生物科学（BD Biosciences))以及SMART SCRIBE(Clontech公司（Clontech))。适用于本发明的TS0可包括 条形码，包括但不限于分子条形码或样品条形码。
[0073] 根据本发明合成的cDNA可具有与根据任何文献方法合成的c