涉及分离的植物内生菌的组合物和方法
【技术领域】
[0001] 本公开内容涉及分离的植物内生菌及其用途，例如用于接种植物以促进胁迫耐受 性和/或增加生长或发芽。
【背景技术】
[0002] 共生(定义为两种或更多种生物体以紧密或亲密的关系生活在一起)通常是2种生 物体之间的互利相互作用。多数的植物是与真菌共生的（Petrini，1986)，并且这些真菌在 植物群落的结构、功能以及健康和适应中起重要的作用(Bacon and Hill, 1996;Clay and Holah,1999；Petrini,1986；Read,1999；Rodriguez and Redman,1997)〇
[0003] 已经证明与真菌的共生关系可以增强宿主植物在胁迫条件下的生长。例如，植物 内生真菌的特定菌株赋予宿主植物针对极端环境条件(包括温度、干旱和盐度）的耐受性 (Redman等人，2002b;Rodriguez等人，2004;Rodriguez and Redman，2008;Rodriguez等人， 2009;Redman等人，2011;Rodriguez等人，2012)。植物内生菌是一类驻留在宿主植物根、茎 和/或叶中的真菌共生体。除了促进胁迫耐受性以外，植物内生菌还增加宿主植物的养分获 取和生长速率(生物量和产率），并改善水利用效率(Rodriguez等人，2008; Rodriguez等人， 2009) 〇
[0004] 非生物胁迫(例如干旱、温度、盐度、pH和养分）改变植物的生理学，从而导致降低 的适应性、健康、发育和产率。在边缘生长条件(通常由于非生物胁迫)下繁殖植物会使得农 作物和原生植物的农业产量得到增加和气候诱导的生境变化得到缓解。此外，产生新的植 被对于由现代工业和其它人类活动导致的污染场所的土壤和水补救而言是重要的。
[0005] 之前公开的研究（Redman等人，2002b&2011; Rodriguez等人，2008&2012)已经证明 特定种类的真菌共生体(种类2)可以简单地通过使用植物内生真菌定植植物而给植物赋予 生物和非生物胁迫益处。
[0006] 发明概述
[0007] 如本文所述，已发现与之前鉴定的植物内生真菌相比，诸如哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)(例如菌株ThLml)的植物内生真菌赋予优异的非生物/生物胁迫 耐受性，并增加农业和原生植物的产率。因此，本公开内容的多个方面涉及与分离的植物内 生真菌有关的组合物和方法，其中所述植物内生真菌例如为物种哈茨木霉，包括菌株 ThLml〇
[0008] 根据本发明的一个方面，提供了分离的哈茨木霉菌株ThLml真菌或者其后代或孢 子，所述哈茨木霉菌株ThLml真菌保藏于美国农业研究菌种保藏中心，专利保藏指定编号为 NRRL 50846(保藏日期2013年7月26日）。还提供了包含哈茨木霉菌株ThLml真菌和/或其后 代和/或孢子的组合物。所述组合物包括例如液体组合物和粉末组合物。
[0009] 根据本发明的另一个方面，提供了用于促进胁迫耐受性和/或增强植物生长或种 子发芽的方法。该方法包括使用分离的哈茨木霉菌株ThLml真菌或其孢子或后代、或者其组 合物接种植物或植物种子。在一些实施方案中，胁迫耐受性为干旱耐受性、盐耐受性、养分 减少耐受性、真菌耐受性和/或温度耐受性。在一些实施方案中，增强的植物生长或种子发 芽包括大小、根发育的程度、种子的发芽率、叶绿素含量/水平、光合效率、产率或质量的增 加。
[0010] 在一些实施方案中，接种植物可以包括使用哈茨木霉菌株ThLml真菌或其孢子或 后代定植植物的根和/或茎。
[0011] 在一些实施方案中，方法进一步包括使植物或植物种子生长，所述生长可以处于 特征为高盐度、低水分和/或低养分含量的土壤中。在一些实施方案中，高盐度为高于35mM 的盐量。在一些实施方案中，低水分含量为〇-〇. 18in3水/in3土壤。在一些实施方案中，低养 分含量为低于801bs/英亩的养分，其中所述养分包含各20%的氮、磷和钾，以及相关的微量 元素养分。
[0012] 在一些实施方案中，植物或植物种子在特征为高盐度和/或低养分含量的水中生 长。
[0013] 在一些实施方案中，植物或植物种子在平均温度为或高于35°C、或者平均温度为 或低于15°C生长或发芽。
[0014] 在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜、 番前、玉米、小麦、大豆、萌芦科植物(cucurbits)、胡椒(peppers)、绿叶蔬菜、大麦、棉花、豆 (beans)、豌豆(peas)、块茎、浆果、木本植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中， 植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科、百合科、杜鹃花科（Azalea)、杜鹃花属 (Rhododendron)、禾本科或菊属。
[0015] 根据本发明的另一个方面，提供了植物或植物种子，其接种有分离的哈茨木霉菌 株ThLml真菌或其孢子或后代、或者其组合物。
[0016] 在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜， 番茄，玉米，小麦，大豆，萌芦科植物，胡椒，绿叶蔬菜，大麦，棉花，豆，豌豆，块茎，浆果，木本 植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇 科，百合科，杜鹃花科，杜鹃花属，禾本科或菊属。
[0017] 根据本发明的另一个方面，提供了用于增加胁迫耐受性的方法。该方法包括使用 分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物 或植物种子，由此增加所接种的植物的胁迫耐受性。
[0018] 在一些实施方案中，胁迫为干旱、盐升高、养分减少和/或温度胁迫。在一些实施方 案中，胁迫不是多环芳香烃、环烷酸或高pH的存在。
[0019] 在一些实施方案中，接种植物包括使用哈茨木霉菌株真菌或其孢子或后代定植植 物的根、茎和/或叶。
[0020] 在一些实施方案中，方法进一步包括使植物或植物种子生长，所述生长可以处于 特征为高盐度、低水分和/或低养分含量的土壤中。在一些实施方案中，高盐度为高于35mM 的盐量。在一些实施方案中，低水分含量为〇-〇. 18in3水/in3土壤。在一些实施方案中，低养 分含量为低于801bs/英亩的养分，其中养分包括各20%的氮、磷和钾，以及相关的微量元素 养分。
[0021] 在一些实施方案中，植物或植物种子在特征为高盐度和/或低养分含量的水中生 长。
[0022] 在一些实施方案中，植物或植物种子在平均温度为或高于35°C、或者平均温度为 或低于15°C生长或发芽。
[0023] 在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜、 番茄、玉米、小麦、大豆、萌芦科植物、胡椒、绿叶蔬菜、大麦、棉花、豆、豌豆、块茎、浆果、木本 植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇 科、百合科、杜鹃花科、杜鹃花属、禾本科或菊属。
[0024]在一些实施方案中，哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-l或菌株T-22。
[0025]根据本发明的另一个方面，提供了用于增加种子发芽的方法。该方法包括使用分 离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢子的组合物接种植物种 子，由此增加所接种的种子的发芽。
[0026] 在一些实施方案中，使用杀真菌剂(fungicide)和/或杀昆虫剂（insecticide)预 先、同时和/或随后处理植物种子。
[0027]在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜、 番茄、玉米、小麦、大豆、萌芦科植物、胡椒、绿叶蔬菜、大麦、棉花、豆、豌豆、块茎、浆果、木本 植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇 科、百合科、杜鹃花科、杜鹃花属、禾本科或菊属。
[0028]在一些实施方案中，哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-l或菌株T-22。
[0029] 根据本发明的另一个方面，提供了用于减少植物中非哈茨木霉的真菌的建立的方 法。该方法包括使用分离的哈茨木霉真菌或其孢子、或者包含分离的哈茨木霉真菌或其孢 子的组合物接种植物种子或幼苗，由此减少从所接种的种子或幼苗生长的植物中非哈茨木 霉的真菌的建立。
[0030] 在一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作物植物种子，例如西瓜、 番茄、玉米、小麦、大豆、萌芦科植物、胡椒、绿叶蔬菜、大麦、棉花、豆、豌豆、块茎、浆果、木本 植物或稻，或者它们的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇 科、百合科、杜鹃花科、杜鹃花属、禾本科或菊属。
[0031] 在一些实施方案中，哈茨木霉菌株真菌不是菌株TSTh20-l或菌株T-22。
[0032]在下文的描述中，示出了本发明的一个或多个实施方案的详情。根据以下的附图 和多个实施方案的详述、并且还根据所附的权利要求书，本发明的其它特征或益处将显而 易见。
[0033] 附图简述
[0034]以下附图形成了本说明书的一部分，并且包含这些附图以进一步证明本公开内容 的某些方面，通过参照这些附图的一个或多个，并结合本文呈现的特定实施方案的详细描 述，可以更好地理解本公开内容。
[0035]图1为显示玉米幼苗对ThLml的生物量反应的柱状图。非共生的(NS-每对中左侧的 柱）以及与ThLml共生的（S-每对中右侧的柱）玉米植物(N=24)在无胁迫下在温室中生长1 个月。Y轴上的值为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
[0036]图2为描绘通过与ThLml共生而使得玉米生长和产率增加的柱状图。左侧=非共生 的(NS)，右侧=与ThLml共生的（S)。Y轴上的值为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
[0037]图3为显示通过与ThLml共生而使得玉米生长和产率增加的图。左侧2个柱=非共 生的（NS)，右侧2个柱=与ThLml共生的（ShY轴上的值为湿重，以克（g)计，并显示平均重 量。
[0038]图4为描绘与ThLml共生的（S)或非共生的（NS)的玉米的种子发芽的柱状图。左侧 =非共生的（NS)，右侧=与ThLml共生的（ShY轴上的值表示种子发芽百分率，并显示平均 值。
[0039]图5为描绘共生玉米植物中增加的叶绿素含量的图。左侧=非共生的(NS)，右侧= 共生的（S)，对在不存在胁迫的情况下温室生长的成熟玉米植物就叶绿素含量(Y轴，数字为 SPAD值)进行测量，并显示平均值。
[0040]图6A为显示暴露于干旱胁迫的玉米植物的根和苗（shoot)重量的一系列柱状图。 各图中左侧的柱=非共生的（NS)，各图中右侧的柱=与ThLml共生的（ShY轴上的值为湿 重，以克(g)计，并显示平均重量。
[0041]图6B为显示暴露于低养分胁迫的玉米植物的根和苗重量的柱状图。各图中左侧的 柱=非共生的（NS)，各图中右侧的柱=与ThLml共生的（ShY轴上的值为湿重，以克(g)计， 并显示平均重量。
[0042]图7为描绘暴露于盐胁迫的玉米的重量的柱状图。左侧=非共生的(NS)，右侧=与 ThLml共生的（S) 3轴上的数字为湿重，以克(g)计，并显示平均重量。
[0043]图8为描绘稻幼苗中的寒冷胁迫耐受性的图。根生物量通过各柱的上半部分描绘。 显示了根和苗的生长(cm)。苗的生长通过各柱的下半部分描绘。
[0044]图9为描绘在干旱胁迫下田地评价的图。显示了各自包含120个玉米植物的5个重 复样地的产率数据。与ThLml共生的植物产生比非共生的(NS)植物平均85%更高的产率。 [0045]图10为显示非共生的（NS)或与ThLml共生的（S)的玉米的苗和根生物质的图。Y轴 上的值为鲜重生物质，以克(g)计。
[0046]图11是显示使用ThLml接种的共生玉米植物产生更加伸展的具有更多侧根的根系 统的照片。图11为来自图10的植物的非共生的(NS，左侧)和共生的（S，右侧）的根的代表性 照片。
[0047]图12为显示非共生的（NS)或与ThLml共生的（S)大豆的根和苗生物质的柱状图。Y 轴上的值为鲜重生物质，以克(g)计。
[0048]图13为描绘玉米植物的叶的叶绿素含量的柱状图。采用SPAD测量，其指示叶绿素 相对％。3个"S"柱的每一个表示ThLml的3种独特的制备物。
[0049] 图14为与ThLml共生的（S，右侧的柱）或非共生的（NS，左侧的柱）的大豆植物的 SPAD测量的柱状图。SPAD测量指示植物中的叶绿素相对％。
[0050] 图15为显示与ThLml的不同制备物共生的（S)或非共生的（NS)玉米的果实产率的 柱状图。
[0051] 图16为描绘与ThLml共生的（S，各图中的右侧的柱)或非共生的(NS，各图中的左侧 的柱)玉米植物在低养分胁迫下的根、苗和产率的一系列柱状图。
[0052]图17为描绘与ThLml共生的（S，各图中的右侧的柱)或非共生的(NS，各图中的左侧 的柱)玉米植物在干旱胁迫下的根、苗和产率的一系列柱状图。
[0053]图18为描绘与ThLml共生的（S，左侧的柱）或非共生的（NS，右侧的柱）大豆植物在 盐胁迫下的根和苗生物量的柱状图。
[0054]图19为描绘与ThLml共生的（S，左侧的柱）或非共生的（NS，右侧的柱）玉米在盐胁 迫下的苗和根生物量的柱状图。
[0055]图20为描绘暴露于高温的非共生的（NS)或ThLml共生的（S)玉米植物的生长的柱 状图。在暴露于高温(45-50°C)2周后，测量共生的（各对中的右侧的柱)和非共生的（各对中 的左侧的柱)玉米植物的生长。
[0056]图21为描绘暴露于高温的非共生的（NS)或ThLml共生的（S)番茄植物的生长的柱 状图。在暴露于高温(45-50°C，右侧对）或正常温度（25-30°C，左侧对）2周后，测量共生的 (各对中的右侧的柱)和非共生的(各对中的左侧的柱)玉米植物的生长。
[0057] 图22为使用ThLml处理的（S)或未使用ThLml处理的（NS)玉米种子在高温（50-55 °C)的发芽百分比的图。
[0058] 图23为使用ThLml处理的（S)或未使用ThLml处理的（NS)大豆种子在高温（50-55 °C)的发芽百分比的图。
[0059] 图24为使用ThLml处理的（S)或未使用ThLml处理的(NS)玉米种子在暴露于寒冷温 度(5°C)144小时的发芽百分比的图。测试3种玉米种类(A、P和D)。
[0060] 图25为