菌株(例如ThLml)定植植物的根和/或茎。
[0132]在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括使植物或植物种子生长。植物或 植物种子可以在一种或多种胁迫条件下生长，例如干旱条件、高盐条件、养分减少条件、低 光照条件、寄生真菌条件和/或高温条件。
[0133] 因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括使植物或植物种子在特征为高盐 度、低水分和/或低养分含量的土壤中生长。特征为高盐度的土壤包括土壤中存在的盐(例 如Na、Mg、Ca或K氯化物、硫酸盐或碳酸盐）量高于35mM的土壤，例如高于：35mM，40mM，45mM, 50mM,60mM,70mM,80mM,90mM,lOOmM,120mM,140mM,160mM,180mM,200mM,250mM,300mM, 350mM，400mM，450mM，500mM或更高的盐量。特征为低水分的土壤包括取决于土壤类型具有 0-0.18in 3水/in3土壤的土壤，例如低于：0.18,0.17,0.16,0.15,0.14,0.13,0.12,0.11， 0.10,0.09,0.08,0.07,0.06,0.05,0.04,0.03,0.02 或 O.Olin3 水/in3 土壤。特征为低养分含 量的土壤包括具有低于801bs/英亩的养分(包括各自为20%的氮、磷和钾(NPK)，以及相关 的微量元素养分）的土壤，例如低于：75,70，65,60,55,50，45,40,35,30,25,20,15,10或 51bs/英亩的养分。
[0134] 在一些实施方案中，本文提供的方法包括使植物或植物种子在平均温度为或高于 36°C 生长，例如在 36,37,38,39,40,41，42,43,44,45,46,47,48,49,50°C 或更高的温度生 长。在一些实施方案中，所述方法包括使植物种子在平均温度为或高于36°C发芽，例如在 36,37,38,39,40,41，42,43,44,45,46,47,48,49,50或更高的温度发芽。
[0135] 在一些实施方案中，本文提供的方法包括使植物或植物种子在平均温度为或低于 15°C生长，例如在15，14，13，12，11，10,9,8,7,6,5或更低的温度生长。在一些实施方案中， 所述方法包括使植物种子在平均温度为或低于15°C发芽，例如在15,14,13,12,11，10，9,8， 7，6,5或更低的温度发芽。
[0136] 在本文提供的任何方法的一些实施方案中，植物或植物种子为农作物植物或农作 物植物种子。在一些实施方案中，农作物植物或农作物植物种子为西瓜，番茄，玉米，小麦， 大豆，萌芦科植物，胡椒，绿叶蔬菜，大麦，棉花，豆，豌豆，块茎，木本植物，浆果或稻，或它们 的种子。在其它的实施方案中，植物或植物种子为观赏植物，例如蔷薇科，百合科，杜鹃花 科，杜鹃花属，禾本科或菊属。
[0137] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语意欲具有相关领域的普通技 术人员通常理解的相同含义。
[0138] 如本文所用，单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数参照物，除非上下文另外 地清楚说明。
[0139] 本说明书中引用的所有出版物和专利申请均以引用方式并入本文，如同每一份单 独的出版物或专利申请明确地且单独地指明以引用方式并入本文。
[0140]无需进一步的详细阐述，据信本领域技术人员可以基于上述描述，最大程度地利 用本发明。因此，以下的具体实施方案应解释为仅是举例说明性的，并且无论如何不以任何 方式限制本公开内容的其余部分。为了本文参考的目的或主题，本文引用的所有出版物均 以引用方式并入本文。 实施例
[0141] 实施例1 .ThLml作为有益共生体的分离和鉴定
[0142] ThLml的分离和接种
[0143] 哈茨木霉菌株ThLml是由生长在华盛顿州的海滩上的草(禾本科)物种分离的。对 这些植物的栖息地胁迫被鉴定为干旱、低土壤养分和升高的盐度。从San Juan Island Archipelago，WA的几个海滩栖息地收集滨麦(Leymus mo 11 i s)(沙丘草)植物。清洗植物直 至除去土壤残渣，放置于塑料拉链锁袋子中，并按照之前所述进行表面灭菌(Redman等人， 2001，2002a)。使用无菌技术，将植物切成代表根、根茎和茎的部分，铺板于真菌生长培养基 [0.1 X PDA(马铃薯葡萄糖琼脂）]上，并在冷荧光下在室温温育5-7天以允许真菌出现。当出 现后，将所代表的优势植物内生真菌(X95% )的30个代表性分离物传代培养，并且在其中， 按照之前所述对10个代表性分离物进行单孢子分离(Redman等人，1999)。所有10个代表性 分离物均置于无菌1.5ml螺帽管中的无菌水(补充有50-100mg/ml氨节青霉素）中，并放置在 4°C用于长期储存。
[0144] 使用ThLml定植种子和植物
[0145] 使用ThLml接种几株测试植物。将玉米(Zea mays)和大豆(Glycine max)种子在 0.5-1.0% (v/v)次氯酸钠溶液中表面灭菌15-20分钟，并伴随温和的搅拌，使用10-20体积 的无菌蒸馏水漂洗。这些植物物种代表2种主要的植物谱系一单子叶植物和真双子叶植物。 然而，ThLml还与许多其它的植物(包括蔬菜(例如番茄，萌芦科植物，胡椒，豌豆，豆，草地， 绿叶蔬菜等），主要农作物(例如小麦，稻，大麦，块茎），草和木本植物)建立共生关系，所述 这些植物均按照针对玉米和大豆所描述的使用ThLml定植来进行处理。可以通过使用孢子 的液体或粉末配制物（10-10000个孢子/种子)直接处理(喷雾、浸泡、混合或浇水)种子、幼 体、幼苗或较老阶段的植物来使植物建立与ThLml的共生关系。可以将孢子施加在植物的任 何部分上，其中通过接种较低的茎和根获得最佳的结果。
[0146] 发现ThLml与接种ThLml的许多植物物种(包括农作物植物和原生植物)建立了共 生关系。发现接种ThLml赋予胁迫耐受性。接种ThLml的并具有改善的胁迫耐受性的植物的 概括示于表2中。
[0147] 表2.接种ThLml的植物
[0148]
[0149]
[0150] 在不存在胁迫的情况下ThLml增加植物生长和健康
[0151] 将玉米植物接种或不接种ThLml，并使其在温室中在不存在胁迫的情况下生长1个 月。然后，将玉米植物分成根和苗部分用于湿重测量。重量测量的统计学分析显示接种 ThLml的植物(与ThLml共生的）比未接种的植物显著更大(AN0VA，P〈0 · 05，图1)。
[0152] 还在接种或未接种ThLml的玉米植物中测量玉米的生长和产率。在不存在胁迫的 情况下，成熟的温室植物进一步生长以产生玉米穗(产率)用于湿重测量。统计学分析显示， 接种ThLml的植物（与ThLml共生的）产生比未接种的植物显著更高的产率(N = 48;P>0.05， 图2)。
[0153] 进一步测量在不存在胁迫的情况下生长的ThLml接种的玉米中的玉米生长和产率 增加。将在不存在胁迫的情况下生长的成熟温室植物分成全株重量(生物量)或玉米穗(产 率）用于湿重测量。统计学分析显示接种ThLml的植物（与ThLml共生的）比未接种的植物显 著更大(Ν=48;Ρ>0·05,图 3)。
[0154] 还测量了 ThLml接种的植物的种子发芽增强。在植物生长恒温器和温室中测量了 在胁迫存在和不存在情况下的玉米种子发芽。统计学分析显示接种ThLml的种子(与ThLml 共生的）具有比未接种的(NS)种子显著更高的发芽率(N= 100; SD〈5 ;P〈0.05，图4，22-25)。
[0155] 还测量了 ThLml接种的植物的叶绿素含量。测量了在不存在胁迫的情况下生长的 成熟温室玉米植物的叶绿素含量％。统计学分析显示ThLml接种的植物(与ThLml共生的）具 有比未接种的植物更高的叶绿素含量(N = 9;P>0.05,图5,13,14)。作为一般性观察，ThLml 接种的植物看起来比未接种的植物更绿并且更健壮。
[0156] 这些数据显示植物的ThLml接种在不存在胁迫的情况下普遍增加植物健康，包括 植物生长、产率、发芽率和叶绿素含量。
[0157] 在存在胁迫的情况下ThLml增加植物生长和健康
[0158]还测试了胁迫条件以确定接种ThLml的植物是否比未接种ThLml的植物更健康。在 暴露于干旱胁迫的玉米植物中测量根和苗重量，所述玉米植物预先接种或未接种了 ThLml。 使60日龄的玉米植物暴露于无胁迫(每2天充分浇水）、中等的干旱胁迫(每4天浇水)或高度 的干旱胁迫(每7天浇水）。然后，针对来自高度干旱暴露的植物的生物量(根和苗)来评估植 物。将植物分成根和苗部分用于湿重测量。统计学分析显示，接种ThLml(与ThLml共生的）比 未接种的植物显著更大(N=36;P>0.05,图6A)。
[0159]还在暴露于低养分胁迫的玉米植物中进行根和苗的测量，所述玉米植物预先接种 或未接种了 ThLml。对1周龄的玉米植物给予具有养分的初始浇水(基于氮、磷和钾的植物肥 料，NPK)，此后，在试验过程中（大约90天），每2天将植物暴露于无养分胁迫(具有完全强度 NPK的浇水)或低养分胁迫(具有1/4强度NPK的浇水）。然后针对生物量(根和苗)来评估植 物。将植物分成根和苗部分用于湿重测量。统计学分析显示接种ThLml的植物(与ThLml共生 的）比未接种的植物显著更大(N=36;P>0.05,图6B)。
[0160]在盐胁迫下在预先接种或未接种ThLml的玉米植物中进行重量测量。将60日龄的 植物每2天暴露于无盐胁迫(使用标准水平的NPK浇水)或盐胁迫(在标准的NPK溶液中具有 200mM NaCl)，持续30天。测量植物湿重。统计学分析显示接种ThLml的植物（与ThLml共生 的）比未接种的植物显著更大(N=36;P 2 0.05,图7)。
[0161] 在预先接种或未接种ThLml的稻幼苗中测量寒冷胁迫耐受性。将稻幼苗暴露于冷 水胁迫。2周后，针对根和苗生物量(湿重g)评估稻幼苗。接种ThLml的稻具有显著更大的根 和苗(Ν=10;Ρ〈0.05,图 8)。
[0162] 还实施在干旱胁迫下的田地评价。使植物在Michigan, USA的旱地栽培下生长，并 使其暴露于50年中最严重的干旱。针对每个样地包含120株玉米植物的4个重复样地获得产 率数据。接种ThLml的植物(与ThLml共生的）产生比未接种的植物平均85 %更高的产率，图 9〇
[0163] 这些数据显示ThLml的接种改善在胁迫条件(包括干旱、低养分、温度和盐胁迫)下 的植物健康，例如生长和产率。
[0164] 总结
[0165] 总之，数据显示ThLml的接种增加种子发芽率和幼苗生长，赋予对各种胁迫(盐、温 度、干旱、养分）的耐受性，增强总体健壮性和健康(例如叶绿素％增加），以及增加产率。此 外，发现(数据未显示)ThLml在竞争植物定植中能够竞争性地胜出其它的微生物，并且通过 这样的行为，能够在广泛的农作物植物（例如大豆、稻和玉米）中，阻碍病原生物体的进入 (由此降低疾病的发生率）。接种后ThLml提供给植物的益处的列表概述于表3中。
[0166] 表3. ThLml接种的植物的益处
[0167]
[0168] 实施例2.具有ThLml的植物的分离和接种
[0169] ThLml 的分离
[0170]为了分离ThLml，清洗植物直至除去土壤残渣，放置于塑料拉链锁袋子中，并按照 之前所述进行表面灭菌(Redman等人，2001，2002a)。使用无菌技术，将植物切成代表根、根 茎和茎的部分，铺板于真菌生长培养基[0. IX PDA(马铃薯葡萄糖琼脂，Difco)]上，并在冷 荧光下在室温温育5-7天，以允许真菌出现。在出现后，将所代表的优势植物内生真菌的30 个代表性分离物传代培养，并且在其中，按照之前所述对10个代表性分离物实施单孢子分 离(Redman等人，1999)。所有10个代表性分离物均置于无菌1.5ml螺帽管中的无菌水(补充 有50-100mg/ml氨苄青霉素）中，并放置在4°C用于长期储存。
[0171]培养 ThLml
[0172] 在0.1X马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(Difco)上培养ThLml。所述培养基补充有 50-lOOug/ml氨苄青霉素、四环素和链霉素，并使真菌培养物以12hr光照方案在22°C生长。 在生长5-14天后，通过加入10ml无菌水并使用无菌载玻片轻柔地刮掉孢子而从平板收获分 生孢子。使用无菌水将孢子的最终体积调节至l〇〇ml，过滤通过4层无菌粗棉纱布，并将孢子 浓度调节至1〇 4_1〇5个孢子/ml。
[0173] ThLml 的鉴定
[0174] 利用分生孢子梗和分生孢子形态学来鉴定真菌(Arx, 1981 ;Barnett and Hunter, 1998;Leslie and Summerell，2005)。在来自滨麦的分离物在显微镜下被鉴定为相同的真 菌物种后，随机地选择3个分离物用于分子物种鉴定。物种的指定基于rDNA的可变ITS1和 ITS2 序列[ITS4(5'-tcctccgcttattgatatgc-3'；SEQIDN0:l)/ITS5(5'-ggaagtaaaagtcgtaacaagg_3'；SEQ ID N0:2)引物]和翻译延长因子|^?11'(5'-atgggtaaggaggacaagac_3'；SEQ ID N0:3)/EF2T(5'-ggaagtaccagtgatcatgtt_3'；SEQ ID N0:4)以及EFll(5'-gtggggcatttaccccgcc-3' ；SEQ ID N0:5)/EF22(5'-aggaacccttaccgagctc-3' ；SEQ ID N0:6)引物（O'Donnell等人，2000;White等人，1990)]的 序列分析。按照之前所述，从菌丝体提取DNA并进行PCR扩增（Rodriguez，1993; Rodriguez and Yoder，1991)。将PCR产物测序并针对GenBank数据库进行BLAST检索。形态学和GenBank 分析鉴定该3个分离物/种类为相同的物种(哈茨木霉），并就植物益处测试所有的分离物。
[0175] 哈茨木霉菌株ThLml的益处
[0176] 进行一系列研究以评估哈茨木霉菌株ThLml对单子叶植物(玉米)和真双子叶植物 (大豆和/或番茄)的益处，以证明该真菌与两种谱系的植物建立有益的共生关系。
[0177] 在不存在胁迫的情况下ThLml增加植物生长和健康
[01