使用ThLml处理的（S)或未使用ThLml处理的(NS)大豆种子在暴露于寒冷温 度(5°C或15°C) 72小时的发芽百分比的图。
[0061] 图26为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的干旱胁迫耐受 性的图。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(η = 36)。使植物暴露于干旱胁迫(完全不浇水)9天，并且标准偏差低于5%。未萎蔫=植物具 有完全膨胀并且与在不具有植物胁迫下生长的植物无不同；轻微萎蔫=植物具有完全膨胀 但在顶端具有轻微的叶卷边;永久性萎蔫点=当重新浇水时植物不能从其恢复的严重萎 蔫。
[0062] 图27为由哈茨木霉分离物赋予大豆的干旱耐受性的代表性图像。将植物暴露于干 旱条件6天，所有的NS植物均萎蔫，而Ε1定植的植物保持完全的膨胀。在干旱胁迫过程中，Ε1 定植的植物还继续生长，如通过植物大小可见的。
[0063]图28为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的干旱胁迫耐受 性的图。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(η = 36)。使植物暴露于干旱胁迫(完全不浇水)9天，并且标准偏差低于5%。未萎蔫=植物具 有完全膨胀并且与在不具有植物胁迫下生长的植物无不同；轻微萎蔫=植物具有完全膨胀 但在顶端具有轻微的叶卷边;永久性萎蔫点=当重新浇水时植物不能从其恢复的严重萎 蔫。
[0064]图29为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的盐胁迫耐受性 的图。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(η = 36)。使植物暴露于盐胁迫(300mM NaCl) 14天，其中标准偏差〈10 %。与非共生的对照植物相 比，所有植物内生菌均显著地增加了植物根生物量。所有共生的植物均是健康的，而NS植物 是萎黄的且萎蔫的。
[0065]图30为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的盐胁迫耐受性 的图。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n = 36)。使植物暴露于盐胁迫(300mM NaCl) 14天，其中标准偏差〈10 %。与非共生的对照植物相 比，所有植物内生菌将用水量降低超过100%。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎 黄的且萎蔫的。
[0066]图31为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的盐胁迫耐受性 的图。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n = 36)。使植物暴露于盐胁迫(300mM NaCl) 14天，其中标准偏差〈10 %。与非共生的对照植物相 比，所有植物内生菌将用水量降低超过300%。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎 黄的且萎蔫的。
[0067]图32为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的盐胁迫耐受性 的图。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n = 36)。使植物暴露于盐胁迫(300mM NaCl) 14天，其中标准偏差〈10 %。与非共生的对照植物相 比，所有植物内生菌使植物根生物量增加12-32%。所有共生的植物均是健康的，而NS植物 是萎黄的且萎蔫的。
[0068]图33为显示由11种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的热耐受性的图。 NS (非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(η = 36)。使 植物暴露于45°C根部温度10天，其中标准偏差〈10%。与非共生的对照植物相比，所有植物 内生菌使植物苗高度增加15-46%。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫 的。
[0069]图34为显示由11种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的热耐受性的图。 NS (非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(η = 36)。使 植物暴露于45°C根部温度10天，其中标准偏差〈10%。与非共生的对照植物相比，所有植物 内生菌使植物叶的叶绿素水平增加16-37%。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄 的且萎蔫的。
[0070] 图35为显示由6种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的热耐受性的图。 NS (非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(η = 36)。使 植物暴露于45°C根部温度10天，其中标准偏差〈10%。与非共生的对照植物相比，所有植物 内生菌使植物用水量降低26-77%。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫 的。
[0071] 图36为显示由6种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的热耐受性的图。 NS (非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(η = 36)。使 植物暴露于45°C根部温度10天，其中标准偏差〈10%。与非共生的对照植物相比，所有植物 内生菌使植物根生物量增加30-100%。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且 萎蔫的。
[0072] 图37为显示由哈茨木霉的分离物(ThLml)赋予大豆植物的寒冷耐受性的图。NS(非 共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9个种子的3个重复(n = 27,标准偏差 〈10%)。对种子进行接种并在5°C、15°C和25°C放置72小时，以评估发芽。与非共生的对照植 物相比，在所有温度，植物内生菌赋予寒冷耐受性并增加种子发芽。
[0073]图38为显示由哈茨木霉的分离物(ThLml)赋予玉米植物的寒冷耐受性的图。NS(非 共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9个种子的3个重复(n = 27,标准偏差 〈10%)。对3种玉米种类(A、P、D)的种子进行接种并在15°C放置96小时，以评估发芽。与非共 生的对照植物相比，植物内生菌赋予寒冷耐受性并显著增加种子发芽。
[0074] 图39A-39C表示显示在发芽后2周的非共生的(NS)和共生的（TT = ThLMl)玉米幼苗 中随时间过去所测量的光合效率(Qmax，Y轴）的一系列图。使植物在不存在胁迫（图39A)、或 者在干旱胁迫（图39B)或热胁迫（图39C)的存在下生长。在所有情况下，量子效率显著高于 共生的植物。
[0075]图40为显示在Michigan，USA的一个场所中在干旱胁迫后的平均玉米产率的柱状 图。该场所经过随机化设计，具有25个样地（每个样地为20英尺x20英尺）。使用2种 81〇[1^1丨代@(配制的!1 11^1)处理仏=低数量孢子/种子以及!1=高数量孢子/种子)测试 4种玉米种类，并且具有10个重复/处理，且N=30/处理。使用BioEnsure?的粉末配制物 接种种子，并在2个小时内种植。（所有其它田地研究均涉及液体配制物）。使用 BioEnsure?的处理使得玉米产率相对于未接受处理的植物升高30-85%。
[0076] 图41为显示在Michigan和Indiana, USA的几个生态地带中由独立的合作者建立的 场所处，在低胁迫下的平均玉米产率的柱状图。该场所经过随机化设计，具有总计215个样 地。使用BioE.ns.ure? (配制的ThLmi)处理的样地的总体84 %具有玉米产率的增加，其中 平均增加6.5%，并且增加范围为3-20%。以蒲式耳/英亩计的增加的范围为5-38。
[0077]图42为显示在Texas，USA的2种土壤类型中建立的样地中，在低胁迫下的平均稻产 率的柱状图。该场所经过随机化设计，具有总计105个样地(每个样地为20英尺x20英尺）。使 用2种BioEnsure? (配制的ThLmi)处理测试3种稻种类，并且具有4个重复/处理，播种机 以801b/英亩播种。BioEnsure?诱导的产率增加范围为191-6571bs/英亩，并且田地平 均增加6%，并且增加范围为2.1-18.2%。
[0078]图43为显示在低胁迫下的平均大麦产率的柱状图。一种大麦种类种植在18个随机 的样地(每个样地为2〇英尺x2〇英尺)上。BioEnsure? (配制的ThLmi)处理使大麦产率增 加7 %。
[0079] 图44为显示在盐胁迫下的草产率的柱状图。在30-80mM的恒定盐胁迫存在下评估 总计18个草样地。BioEnsure:? (配制的ThLmi)处理的植物比未接受处理的的植物(未处 理的）具有86 %更多的生物量。
[0080] 图45为显示由15种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的热耐受性的柱 状图。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n = 36)。使植物根暴露于45°C10天，其中标准偏差〈10%。与非共生的对照植物相比，所有植物 内生菌使植物叶的叶绿素水平增加16-37%。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄 的且萎蔫的。
[0081]图46为显示由15种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的热耐受性的柱 状图。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对照植物，各柱表示9株植物的4个重复(n = 36)。使植物根暴露于45°C10天，其中标准偏差〈10%。与非共生的对照植物相比，所有植物 内生菌均增加植物生物量。所有共生的植物均是健康的，而NS植物是萎黄的且萎蔫的。 [0082]图47为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的养分耐受性的 柱状图。对1周龄的大豆植物给予具有氮、磷、钾(NPK)的初始浇水，此后，在试验的过程中 (大约90天），每2天使植物暴露于无 NPK胁迫(具有完全强度NPK的浇水)或高NPK胁迫(具有 1/4强度NPK的浇水）。然后，针对生物量(根和苗)评估植物，并显示高NPK胁迫植物的数据。 NS (非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物。
[0083]图48为显示由16种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的养分耐受性的 柱状图。对1周龄的玉米植物给予具有氮、磷、钾(NPK)的初始浇水，此后，在试验的过程中 (大约90天），每2天使植物暴露于无 NPK胁迫(具有完全强度NPK的浇水)或高NPK胁迫(具有 1/4强度NPK的浇水）。然后，针对生物量(根和苗)评估植物，并显示高NPK胁迫植物的数据。 NS (非共生的)表示不具有植物内生菌的对照植物。
[0084]图49为显示由19种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的种子发芽增强 的柱状图。UT(未处理的)表示不具有植物内生菌的对照种子，各柱表示20个种子。数据表示 高于未处理的对照种子的发芽增强百分比。与未处理的对照种子相比，所有植物内生菌使 种子发芽增加40-70X。
[0085]图50为显示由17种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予玉米植物的寒冷耐受性的 柱状图。寒冷耐受性表达为来自发芽的种子的根(rootradical)长度。NS(非共生的)表示不 具有植物内生菌的对照植物，各柱表示30个幼体(germling)暴露于15°C6天，其中标准偏差 〈10%。与非共生的对照植物相比，所有植物内生菌使幼体生长增加 l〇-32x。所有共生的植 物均是健康的，而NS植物是矮小的和干枯的。
[0086]图51为显示由18种地理学不同的哈茨木霉分离物赋予大豆植物的寒冷耐受性的 柱状图。寒冷耐受性表达为在15°C的种子发芽。NS(非共生的）表示不具有植物内生菌的对 照种子，各柱表示18个种子暴露于15°C4天，其中标准偏差〈10%。与非共生的对照植物相 比，所有植物内生菌使种子发芽增加85-240 %。
[0087]发明详述
[0088]在本世纪中，对农业生产率的可预见的限制包括非生物胁迫，例如干旱、温度极限 和盐度。目前，没有胁迫耐受的农作物植物或能够产生胁迫耐受农作物的商业产品。非生物 胁迫耐受的农作物没能通过育种、突变选择或遗传修饰(GM)方法产生，从而仍然为农业的 "神圣渴望物"。
[0089]玉米、大豆、小麦和稻在世界范围内大量生长，并且被认为是维持人口的最重要的 农作物。然而，种植者在保持农业可持续性所需的高农作物产率中面对许多挑战。近年来， 全球性气候变化在许多农业背景中造成频率增加的严重干旱。通过灌溉可以缓和干旱的影 响，但这是昂贵的应急措施，并且水质/可利用性也在降低。
[0090]存在几种可利用的增加生长、改变植物的养分状态或保护植物对抗微生物或昆虫 病原体的微生物产品（表1; Berg，2009)。
[0091 ]表1.用于农业的微生物产品 [0092]
L0093」哈茨木霉（T. harz ianum)为真菌物种，其涵盖种类厂泛的生理学特化的菌株，其中 的一些菌株用作对抗土壤传播的植物病原体的生物杀虫剂或者用于酶的工业生产(Naseby 等人，2000)。哈茨木霉已经显示在植物中诱导代谢变化，这增加植物对种类广泛的植物病 原体微生物和病毒的抗性(Harman等人，2004)。之前已显示，哈茨木霉菌株T-22在一些条件 下可以增加植物的生长和根的发育。T-22还可以溶解植物养分用于植物摄取，否则这些养 分在某些土壤中是不能被植物利用的(Altomare等人，1999;Harman等人，2004)。此外，发现 哈茨木霉的另一种菌株TSTh20-l(专利保藏指定编号PTA10317)(从被发现在油砂尾矿上生 长的植物分离的植物内生真菌)促进植物的生长，特别是在关于水、有机碳、氮和矿物质含 量、温度和被多环芳香烃或环烷酸污染的亚最佳或胁迫条件下（PCT公开No. W02011/ 032281)。
[0094]如本文所述，在本文中称为ThLml的新型植物内生真菌共生体哈茨木霉菌株是从 在华盛顿州的海滩上生长的草(禾本科(Poacea))物种分离的。该菌株不是已知的植物或动 物病原体。
[0095]当诸如农作物植物和原生植物的其它植物接种哈茨木霉菌株ThLml时，发现此接 种产生多种益处，包括植物种子发芽率、生长和产率的增加;水消耗和NPK(氮、磷和钾)补充 的减少;赋予针对非生物胁迫包括干旱、温度、盐度的耐受性；以及植物总体健康的增强。已 发现ThLml能够定植范围广泛的植物，包括单子叶植物和真双子叶植物，并因此具有交叉植 物/农作物效用。此外，已发现哈茨木霉菌株ThLml完全驻留在植物营养组织中并且不会生 长至已接种的植物的种子或果实中。因此，ThLml具有交叉农作物(cross-crop)效用，可以 用于向消费者提供不含植物内生菌的产品，并且赋予非生物胁迫耐受性(盐、温度、低NPK、 干旱）、生物量和产率增加、以及增加植物总体健康和健壮性。
[0096]哈茨木霉的其它菌株在商业上用作生物杀虫剂、植物生长增强剂并用于工业酶的 生产。未报道有菌株能够如针对ThLml所发现的那样增强种子发芽或者赋予盐度或温度胁 迫耐受性。尽管已报道其它菌株降低水消耗，但ThLml在农业农作