一种基于Ion Torrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因测序领域，特别是高通量测序领域，具体是一种基于Ion Torrent 测序平台的乳腺癌基因BRCAl和BRCA2的DNA文库构建方法。
【背景技术】
[0002] 新一代高通量基因检测技术，当今主要W Illumina公司的化seq，Miseq系列和 Life公司的Ion Torrent?系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等 优势。已被广泛用于各类生物学研究和医学检测。在基因组水平上对还没有参考序列的物 种进行重头测序，获得该物种的参考序列，为后续研究奠定基础。对有参考序列的物种，进 行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测 序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的高速发 展。但全基因组结构复杂，周期长，费用高，限制了它的发展。
[0003] 同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有重要作用。某些疾病的易 感基因通常只占基因组的很小一部分，对运些易感基因的研究并不需要对全基因组进行测 序，而只需要对特定的几个基因进行研究。目标序列捕获测序技术的出现，使得对基因组特 定区域的研究成为可能。运项技术首先合成大量能与基因组特定区域互补结合的寡聚核巧 酸序列，通过PCR扩增富集目标区段，然后用高通量测序技术对运些区段进行测序。与全基 因组测序相比，特定疾病易感基因测序费用更低，测序深度更高，测序结果更加精确，还可 W检测到低频突变。
[0004] 根据现有报道:BRCA 1/2基因突变在遗传性乳腺癌患者中占有很大的比例(40 % ~45% )，且存在于80%的乳腺癌高发家族的患者中。携带BRCAl或BRCA2基因突变的人具有 较高的患有遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征的风险。乳腺癌相关基因BRCAl和BRCA2测序就是 通过设计BRCAl与BRCA2基因区域的引物，通过多重PCR扩增，将目标区域DNA富集后进行高 通量测序。采用BRCAl和BRCA2基因测序，研究者可W对乳腺癌相关基因BRCAl和BRCA2进行 重点研究。运种高针对性的方法可W高效的发现，验证和筛选BRCAl和BRCA2基因变异。相比 全基因组测序，乳腺癌相关基因测序对目标区域BRCAl和BRCA2基因有更准确快速的研究， 适用于针对大量样本的检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于Ion Torrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA 文库构建方法，W解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 一种基于Ion Torrent测序平台的乳腺癌基因BRCA的DNA文库构建方法，具体步骤 如下：
[000引（1)目标区域扩增:将待测样本的DNAW及多重PCR引物，经多重PCR反应，得到第一 样本；
[0009] (2)引物清除:取第一样本与引物清除试剂混合进行反应，得到第二样本；
[0010] (3)接头连接:将第二样本与接头Pl进行接头连接反应，得到第=样本；
[0011] (4)磁珠纯化:将第S样本进行磁珠纯化，得到第四样本；
[001^ (5)文库扩增:将第四样本加入扩增酶Mix和扩增引物进行PCR扩增，并进行磁珠纯 化，得到目的DNA文库；
[0013] (6)文库检测:将得到的文库采用如bit和11~13%的聚丙締酷胺凝胶电泳检测文 库浓度、文库片段大小及文库质量，即得；
[0014] 所述11~13%的PAGE配方为：水，3~4mL 30%丙締酷胺，2022~2062化；5*T邸， 1.2~1.8mL;9~ll%AP，100~120^;TEMED，9~lliiL。
[0015] 作为本发明进一步的方案:步骤(1)中的多重PCR引物为Ion AmpliSeq? BRCAland BRCA2Panel〇
[0016] 作为本发明进一步的方案:步骤(1)中的反应体系为10化体系，反应体系的组成成 分具体为，
[0017]
[001引作为本发明进一步的方案:步骤(1)中PCR反应的循环数为18。
[0019] 作为本发明进一步的方案:步骤(2)中的引物清除试剂为化化Reagent?,加入量 为每个上述IOiiL PCR体系加入0.9~1.化L引物清除试剂。
[0020] 作为本发明进一步的方案:步骤(3)的接头Pl为：
[0021] 日 ' CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3 '
[002。 5 'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3 '。
[0023] 作为本发明进一步的方案:步骤(3)中的标签接头序列是由如下正反两个序列组 成的Ax Adapter:
[0024]
[0025]
[0026]
[0027]
[002引
[0029]
[0030]
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] [00；3 引
[0039]
[0040]
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047] [004引 [0049] [(K)加 ] [0化1 ] [0化2] [0化3] [0化4] [0化5] [0化6] [0化7] [0化引 [0化9]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] [00 化] [0066] [0067] [006引
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075] 作为本发明进一步的方案:所述接头连接反应的体系为14.9~16.1化，接头连接 反应的体系具化为：
[0076]
[0077] 作为本发明进一步的方案:步骤(4)中所用磁珠为Agencourt'' AMPureiB'XP磁珠。
[007引作为本发明进一步的方案：步骤（5)中文库扩增酶Mix为Platinum叩CR SuperMix High Fidelity，引物为Library Amplification Primer Mix。
[0079] 作为本发明进一步的方案:步骤(5)中文库扩增体系为25~27化，具体为：向第四 样本中加入24~26liLPlil^：in山?^';PCRS叩erMixHighFidelity和0.5~1.5liL的Library Amplification Primer Mix。
[0080] 作为本发明再进一步的方案:步骤(5)中文库扩增的PCR循环为4~6。
[0081] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明的方法与W往的基于乳腺癌相关 基因BRCAl和BRCA2的DNA文库的建库方法相比，步骤简单，目标区域富集后通过一次的PCR 扩增，然后采用磁珠纯化产物，即得到测序文库；同时降低了建库的成本，减少了PCR扩增中 引入突变的可能性，使得测序结果更加精确。
【附图说明】
[0082] 图1是本发明基于Ion Torrent?测序平台的乳腺癌相关基因BRCAl和BRCA2的DNA 文库构建方法的流程图。
[0083] 图2是实施例1提供的BRCAl和BRCA2基因的DNA文库构建方法中PCR产物的12 %聚 丙締酷胺凝胶图，其中泳道1、5为DNA分子标准(Takara,20bp DNA ladder)，泳道2、3、4、6、 7、8、9、10、11、12为建库后样本PCR 5个循环后的产物。
【具体实施方式】
[0084] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0085] 本发明公开了乳腺癌易感基因BRCAl和BRCA2的DNA文库构建方法，所用试剂均可 由市场购得：其中，Ion AmpliSeq? BRCAland BRCA2PaneKLife公司），5*Ion AmpliSeq? HiFi Mix(Life公司），FuPa Reagent?(Life公司），Agenc川i"b AMPiireb XP磁珠（Beckman公 司），接头P巧RAdapter(BioC) Scientific)，Platinum?PCR SuperMix Hi曲 FidelitylXife 公司），Libr曰ry Amplific曰tion Primer Mix(Life公司）C
[0086] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0087] 实施例1:基于Ion Torrent?测序平台的乳腺癌相关基因BRCA巧邮RCA2的DNA文库 构建方法
[0088] 本实施例采用 W下试剂：Ion AmpliSeq? BRCAland BRCA2PaneKLife公司），5* Ion AmpliSeq? 化Fi Mix(Life公司）方证a Reagent?(；Life公司），Agenc〇urt?:AMPure?XP 磁珠(Beckman公司），接头Pl 和Adapter(BioC) Scientific)，P!"tini!nii》'PCR SuperMix High Fidelity 化 ife 公司），Library Amplification Primer Mix 化 ife 公司），无水乙酉享， Nuclease-free water，30%丙締酷胺，5*T邸，10%过硫酸锭，TEMED。
[0089] 本方法实验前需要新鲜配置一种试剂:70%乙醇。
[0090] 本实验需用到的仪器和设备：离屯、机、磁力架、移液枪、PCR仪、震荡仪、巧光计 Qiibit K 2.0,垂直电泳仪。
[0091 ]主要实验步骤
[0092] (1)待测样本的DNA采集
[0093] 在本实施例中，DNA样本来自血液或口腔上皮细胞。采用血液基因组DNA提取试剂 盒(天根)提取基因组DNA或采用口腔拭子基因组DNA快速提取试剂盒(原平瞧），按照试剂盒 说明书操作步骤提取。
[0094] (2)对待测样本的DNA进行如柄| 2.0浓度测定
[00巧]1)向样本管中加入 1化 Qubit dsDNA HS Reagent和 199化Qubit dsDNA HS buf f er，縱满混匀4s;
[0096] 2)向已添加工作液的样品管内吸弃化L工作液，加入化L的DNA样品（确保DNA加到 工作液中），縱满混匀4s，每个管子的最终体积为
[0097] 3)所有的管子在室溫下避光解育2min;
[009引 4)在Qubit2.0巧光计的主屏上，按"DNA"键，然后选择dsDNA High Sensitivity分 析模式；
[0099] 5)把样品管放入如bit 2.0巧光光度计，盖上盖子，按"Read";
[0100] 6)选择化1州late Initial初始浓度，然后选择Volume of Sample Used:化L，此 时显示的结果为样本初始浓度，单位ng/iiL
[0101] 7)读取下一个样品：取出Qubit2.0巧光光度计中样品，放入新的样品，按"Read Next Sample";
[0102 ] 8)重复样本读数，直到所有样品读完。
[0103]