凡纳滨对虾dna病毒新型快速检测试剂盒及方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种凡纳滨对邮DNA病毒新型快速检测试剂 盒及方法。
【背景技术】：
[0002] 凡纳滨对邮化itopenaeus vannamei ,又称南美白对邮)在我国对邮养殖中占据绝 对优势地位，已成为我国水产养殖的支柱产业，在中国渔业经济中占有较大的比重。然而， 对邮白斑综合症、早期死亡综合症等病害问题每年给对邮产业造成巨大的损失，严重制约 着该产业的健康发展。DNA类病毒，如:对邮白斑综合症病毒(White Spot Syn化ome Virus, WSSV)及黄头病病毒(Yellow Head Virus，YHV)等是造成凡纳滨对邮上述病害的重要病原。
[0003] 加强病原检测、提前阻断病毒传播是防控病毒疫病最有效的途径之一。现有的技 术方法，如细胞培养、巧光抗体、免疫组织化学、PCR等都存在一定的不足。细胞培养法检测 灵敏度不高，检测时间长;PCR检测法需要特定的仪器设备，且对检测环境要求较高;巧光技 术等则需要经过复杂的操作，对技术人员的专业要求较高。W上种种不利因素都限制了凡 纳滨对邮相关病害现场快速检测及检测方法在基层普及，使得对邮DNA类病毒的防控基本 缺失。
[0004] 环介导等溫扩增技术(Xoop-mediated isothermal Amplification,LAMP)是一种 较新型的PCR技术，通过设计4条特异、高效的引物，能够在等溫条件下不间断地快速扩增目 的序列，具有快速、灵敏、特异性高的优点。但现有的lamp检测试剂盒对实验仪器设备和技 术人员的要求较高，其包含的组份较多，核酸提取过程繁琐，再加上LAMP检测液需要添加各 种引物、酶、反应缓冲液等，容易造成试剂盒污染出现假阳性结果，非常不利于LAMP反应的 推广应用。由于上述限制因素，现行的LAMP检测试剂盒推广应用受到严重制约。
[0005] 因此，开发出一种操作步骤少、简单有效、不易被污染的凡纳滨对邮DNA病毒检测 试剂盒具有重要的应用价值。
【发明内容】
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[0006] 本发明的目的是提供一种操作步骤少、简单有效和不易被污染的凡纳滨对邮DNA 病毒新型快速检测试剂盒及方法。
[0007] 本发明的凡纳滨对邮DNA病毒新型快速检测试剂盒，其特征在于:所述的凡纳滨对 邮DNA病毒新型快速检测试剂盒包括DNA快速提取液和检测液。
[000引优选，所述的检测液含有核酸巧光染料、环介导等溫扩增试剂和检测引物组，所述 的检测引物组为白斑综合症病毒(White Spot Syn化ome Virus)的检测引物组或黄头病病 毒(Yellow Head Virus)的检测引物组。
[0009] 所述的检测液中的白斑综合症病毒的检测引物组，其由下列引物组成：
[0010] 上游外引物。3:5'-41'〔444660：1'刊61'〔661'-3'；（如沈9 10^).1所示）； [00川下游外引物83:5'-661'(：1'〔46160：46461466-3'；（如沈9 10^.2所示）；
[0012] 上游内引物FIP: 5 ' -ACCACACACAAAGGTGCCAACTAGCTCCAACACCTCCTCC-3 ' ；（如SEQ ID NO.3所示）；
[0013] 下游内引物81口：5'-4刊6616〔6〇：444661661'〔616〔4〔614〔4161'〔64-3'；（如沈9 10 ^.4所示）；
[0014] 所述的检测液中的黄头病病毒的检测引物组，其由下列引物组成：
[0015] 上游外引物尸3:5'-6644〔4〇：46164口'〇：41'(：-3'；（如沈9 10備.5所示）
[0016] 下游外引物83:5'-〔4口'61'7^〔6〔666(：1'(：-3'；（如沈9 10備.6所示）
[0017] 上游内引物FIP: 5 ' -ACCATGTCTGGGATGCGCTGTCGACATCGGTATCGCAAGT-3 ' ；（如SEQ ID NO.7所示）
[001 引 下游内引物81口：5'-6646616664〔61761446〔4146416〔461464(：1'〔660：-3'。（如沈9 ID NO.8所示）。
[0019] 优选，所述的DNA快速提取液是Epicentre Biotechnologies公司的 如ic陆xtract?DM Extraction Solution型号的试剂;所述的检测液为环介导等溫扩增反 应液，其20化体系中含有：S-IOUAiL Bst 2.0聚合酶1化，1.0-2. OmM dNTPs 3.化L，10 X Amplification Buffer 2.5化，6-8mMMgS〇4 1.扣L，1M甜菜碱扣L，10XSYT0-9染料0.扣L， 0.2咖上游外引物F3 1化，0.2咖下游外引物B3 1化，1.6咖上游内引物FIP 1化，1.6咖下游 内引物BIP 化L，dd出02化；其中，10 XAmplif ication Buffer含有200mM IYis-HCU IOOmM (NH4)2S〇4、500mM KClJOmM MgS〇4 和质量分数 1 % Tween 20, pH 8.8。
[0020] 所述的检测液所包含的组份已提前混合;所述的DNA快速提取液是直接分装而成 的;所述的DNA快速提取液及检测液都为可直接使用的工作液。
[0021] 本发明还提供了非疾病的诊断和治疗目的的凡纳滨对邮DNA病毒的快速检测方 法，其特征在于:其是应用上述的凡纳滨对邮DNA病毒新型快速检测试剂盒进行检测，具体 包括W下步骤:将样品加入DNA快速提取液中进行DNA提取制成DNA溶液，然后将DNA溶液加 入到含有白斑综合症病毒的检测引物组或黄头病病毒的检测引物组的检测液中，再置于 63-68°C的水浴下保溫1-1.化，若检测液颜色发生改变，则说明样品中含有相应的白斑综合 症病毒或黄头病病毒，如果检测液颜色未发生改变，则说明样品中不含有白斑综合症病毒 或黄头病病毒。
[0022] 优选，所述的将样品加入DNA快速提取液中进行DNA提取制成DNA溶液是将0.1~ 0.5g待检测样品加入DNA快速提取液中剪碎，取上清置于另一干净离屯、管中，剧烈震荡15-20s，65°C保溫6-15min，再剧烈震荡15-20S，最后置于98°C条件下解育2min终止反应，制成 DNA溶液;所述的将DNA溶液加入到含有白斑综合症病毒的检测引物组或黄头病病毒的检测 引物组的检测液中是吸取2-6微升DNA溶液加入20化的含有白斑综合症病毒的检测引物组 或黄头病病毒的检测引物组的检测液中。
[0023] 所述的样品为整个凡纳滨对邮或凡纳滨对邮的部分组织，通过检测凡纳滨对邮或 凡纳滨对邮的部分组织可W获知其是否含有白斑综合症病毒或黄头病病毒，也可W检测凡 纳滨对邮的巧料或水样，W获知凡纳滨对邮的巧料或水样中是否含有白斑综合症病毒或黄 头病病毒。
[0024] 本发明的DNA快速提取液和检测液需要储存于-20°C冰箱中，在4°C完全解冻后方 能使用。
[0025] 本发明采用了快速提取DM、预混检测液的方法，简化了 DNA病毒的检测步骤。本发 明试剂盒组份简单，可简化成3个试管，使用方法可操作性强，适用于检测和防控凡纳滨对 邮DNA病毒的流行。
[0026] 本发明的特点为：1)通过替换检测液中目标病毒特异引物，便可检测相应的DNA病 毒;2)本发明方法不需要经过DNA抽提和浓缩等步骤，DNA提取过程可在一个试管中完成;3) 本发明所有试剂都已进行预混合，极大地降低了污染的机率;4)本发明试剂盒组份简单，可 操作性强，对人员的技术要求低;5)本发明首次将DNA快速提取技术应用于对邮DNA病毒检 测。
[0027] 本发明的有益效果是:本发明分别针对凡纳滨对邮WSSV病毒毒囊膜蛋白VP28基因 序列和YHV病毒的序列，设计和筛选了特异性检测引物组W及含有该检测引物组的检测试 剂盒，及利用该检测试剂盒通过环介导等溫扩增确定待检测凡纳滨对邮中是否存在白斑综 合症病毒或黄头病病毒的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、特异 性强、检测时间短、准确率高、操作简单、对仪器设备要求低、不易被污染的优点，解决了传 统检测方法对设备及检测环境要求高、操作复杂、对技术人员的专业要求较高等缺陷，具有 广阔的应用前景。
【具体实施方式】：
[0028] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0029] 实施例1:
[0030] (1) WSSV病毒的LAMP检测引物组的设计、合成和筛选
[0031] W凡纳滨对邮WSSV病毒为检测对象，在NCBI数据库中检索下载凡纳滨对邮WSSV病 毒囊膜蛋白VP28基因序列（GenBank登陆号为DQ6 8 1069 . 1 )，上传到在线软件 P;rime;rExplorer V4化t1:p ://p;rimere邱Iorer.化/e/)中捜索LAMP引物，将得到的3组LAMP 引物序列，分别按照5 ' '顺序进行合成;取经PCR检测含有WSSV病毒的病邮DNA为模板，分 别利用3组引物进行LAMP反应，W水和对邮基因组DNA为对照，对反应产物进行凝胶电泳，将 条带最亮、最清晰的1组引物作为检测引物组。
[0032] 筛选得到的WSSV病毒的LAMP检测引物组为：
[0033] 上游外引物F3:5' -ATCAAAGGCCTTTGTCGGT-3' ；
[0034] 下游外引物B3:5 ' -GGTCTCAGTGCCAGAGTAGG-3 ' ；
[0035] 上游内引物FIP: 5 ' -ACCACACACAAAGGTGCCAACTAGCTCCAACACCTCCTCC-3 ' ；
[0036] 下游内引物BIP: 5 ' -ATTGGTGCGCCAAAGGTGGTCGTGCACGTACATGTCGA-3 '。
[0037] (2)WSSV 病毒检测
[0038] DNA快速提取液：Epicentre BiotechnoIogies公司的QuickExtract?DNA Extraction Solution型号的试剂。
[0039] 检测液:为环介导等溫扩增反应液，其20化体系中含有:8-10UAiL Bst 2.0聚合酶 ljiL，1.0-2.0mM dNTPs 3.扣UlOXAmplification Buffer 2.扣L，6-8mM MgS〇4 1.5化，11 甜菜碱扣L，10 X SYT0-9染料0.扣L，0.上游外引物F3 1化，0.下游外引物B3化L，1.6 yM上游内引物FIP 1化，1.6咖下游内引物BIP化L，dd此0 其中，IOXAmplification Buffer含有200mM Tris-HCl、100mM(NH4)2S〇4、500mM KClJOmM MgS〇4和质量分数l%Tween 20，pH 8.8，其配制方法是将上述成份混合均匀即可。
[0040] A、在实验室条件下：取Icm左右待检测的凡纳滨对邮幼苗1头，剪取0.1 g肌肉组织 置于如ic陆xtract?DM Extraction Solution化NA快速提取液，购自美国!Epicentre公司） 中剪碎，取上清置于另一干净离屯、管中，用縱满仪剧烈震荡15s，恒溫仪65°C保溫IOminJ! 满仪剧烈震荡20s，置于98°C恒溫仪中解育2min终止反应，制成DNA溶液；用一次性己氏吸 管，吸取扣L DNA溶液加入20化的检测液中，恒溫仪65°C保溫1.化。若检测液颜色发生改变， 则说明样品中含有相应的白斑综合症病毒，如果检测液颜色未发生改变，则说明样品中不 含有白斑综合症病毒。
[0041] 按照上述的快速检测方法，分别W双蒸水作为阴性对照、W收集的一份可能感染 白斑综合症病毒的凡纳滨对邮为待测样品进行检测，每个样品2个重复。经检测，阴性对照 的检测液的颜色未发生变化，而凡纳滨对邮样品的检测液颜色均发生变化，均变为巧光绿 色，即结果为阳性，说明运份凡纳滨对