用于测定胚胎质量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明总体上设及生殖医学领域。更具体地，本发明设及用于测定胚胎质量的方 法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 目前，在辅助生殖技术(ART)中没有用于测定胚胎质量的可靠的可商购的遗传或 非遗传的程序。尤其是，当转移至合适的子宫环境时，测定胚胎是否能够产生存活后代仍然 是一个重要问题。另一个重要问题是测定将使胎儿W及甚至在孩子存活后发育的胚胎的基 因谱。
[0003] 选择具有高移植潜力的胚胎是辅助生殖技术(ART)中的主要挑战之一。最初，使用 多胚胎移植(MET)来使怀孕率最大化。然而，胚胎质量的提高和多胎妊娠率的增加造成用于 替代的胚胎数量减少。因此，选择"最佳"胚胎成为关键，尤其强烈推荐使用选择性单胚胎移 植(SET)。因此，需要开发用于胚胎选择的新的客观的方法。在IVF和ICSI条件下选择健康胚 胎的传统方法基于主观的形态学标准，比如破碎化程度和多核的存在、卵裂球的数量和大 小、早期胚胎分裂化bner等，2003;Fenwick等，2002)。然而，大多数研究表明，仅具有合适形 态学外观的胚胎不足W预测成功的移植。考虑到形态学评估和细胞遗传学筛选方法的局限 性，现在朝着更复杂、高通量的技术发展，出现"组学"科学，例如转录组学和代谢组学。运些 方法关注各种身体细胞和胚胎培养基。我们的团队使用卵细胞(CC)基因表达的转录组学数 据已经报道了用于预测胚胎和妊娠结果的间接且具有吸引力的方法(Assou等，2011 ;Assou 等，2008)。我们观察到胚胎形态学方面和CC基因表达谱之间没有关系(Assou等，2010)。其 他研究报道，用Raman或近红外(NIR)光谱检测的旧培养基的代谢谱与个体胚胎的生殖潜能 相关(Seli等，2007; Vergow等，2008)。他们还表明，来自胚胎的培养基的代谢谱与形态学 无关。
[0004] 移植率降低的另一个主要原因是移植胚胎的遗传质量差。例如，大多数胚胎损耗 和损失由非整倍体(染色体数量异常)造成，所述非整倍体是致死的，且在所有自然流产和 死胎的大约60%中出现。其他遗传崎形包括染色体非整倍体、扩增、易位、插入/缺失、倒位、 短串联重复序列多态性、微卫星多态性、单核巧酸多态性(SNP)和其他结构异常。遗传崎形 可W导致很多表型疾病，一些甚至是致死的。如果遗传崎形在胚胎中出现，可能发生很多类 型的产前病症和先天性疾病。通过着床前遗传学诊断(PGD)筛选运些崎形非常重要，W确保 选择结构上正常的胚胎和存活移植。然而，目前的方法是创伤性的，可能对胚胎产生损害。
[0005] 据报道，在生物液体例如血液、腹水、尿液、羊水、粪便、唾液或脑脊液中可W检测 到细胞游离的DNA。各种核酸，例如DNA、RNA、miRNA实际上是分离的，并且W细胞游离的形式 被检测到。发现CfDNA在健康受试者中是可检测的量，且在一些病理性疾病（癌症、屯、肌梗 塞、自身免疫性疾病、脈毒症、创伤……）或特殊生理状态(紧张的工作……）中含量更高。 rfDNA的释放机制知之甚少，但已经表明可能设及坏死、细胞调亡、吞隧作用或主动释放。 WDNA分析是诊断领域中的主动研究领域，尤其是两个领域目前正经历仔细审查。然而，还 没有研究用于测定胚胎质量的CfDNA检测。
[00(?] 发明简述
[0007]本发明是基于W下重大发现:培养基中存在一定量的细胞游离的核酸，其中胚胎 在体外受精条件下生长。发明人表明，所述培养基中细胞游离的核酸的水平为胚胎引起怀 孕的能力提供信息。此外，发明人表明，分析所述细胞游离的核酸使得检测和表达特定序列 的基因表达成为可能，为开发用于胚胎遗传识别的无创方法作铺垫。
[000引发明详述
[0009] 本发明设及用于测定胚胎质量的体外无创方法，包含由W下组成的步骤：i)提供 其中胚胎生长的培养基样品，ii)从所述样品中提取细胞游离的核酸，和iii)测定核酸提取 物中所述细胞游离的核酸的水平和/或测定核酸提取物中至少一种特定核酸序列的存在 和/或表达水平。
[0010] 如在本文所用，术语"胚胎"具有本领域中的通常含义，是指受精的卵母细胞或受 精卵。术语"胚胎"还指从受精的卵母细胞或受精卵发育直至5或6天(囊胚期）的所有阶段中 的细胞。可W在经典的体外受精(ClVF)条件下或在卵胞浆内单精子注射(ICSI)程序下干预 所述受精。可W通过本发明的方法评估的胚胎的实例包括1细胞胚胎(也称为受精卵）、2细 胞胚胎、3细胞胚胎、4细胞胚胎、5细胞胚胎、6细胞胚胎、8细胞胚胎等。通常直到且包括16细 胞胚胎，其中任何一个可W通过任何方便的方式获得，例如从体内已经成熟的卵母细胞或 从体外已经成熟的卵母细胞获得。如在本文所用，术语"囊胚"是指在哺乳动物早期胚胎发 育中形成的结构，其在桑甚胚形成之后。它具有随后形成胚胎的内细胞群（ICM)或成胚细 胞，和之后形成胎盘的外层细胞或滋养层。滋养层围绕内细胞群和称为囊胚腔的充满液体 的囊胚空腔。人的囊胚包含70-100个细胞。人的囊胚形成在受精后5/6天开始。
[0011] 根据本发明，卵母细胞可W来自ClVF或ICSI的自然周期、改良的自然周期或刺激 周期。术语"自然周期"是指雌性或女性产生卵母细胞的自然周期。术语"改良的自然周期" 是指在用与重组F細或hMG相关的Gn畑括抗剂的轻度卵巢刺激下雌性或女性产生一个或两 个卵母细胞的过程。术语"刺激周期"是指在用与重组FSH或hMG相关的Gn畑激动剂或括抗剂 的刺激下雌性或女性产生一个或多个卵母细胞的过程。
[0012] 术语"经典的体外受精"或"cIVF"是指在体外卵母细胞被机体外部的精子受精的 过程。当体内受精失败时，IVF是不育的主要治疗。术语"卵胞浆内单精子注射"或"icsr是 指其中将单个精子直接注射如卵母细胞的体外受精程序。该程序最常用来克服男性不育因 素，尽管它还可W在当卵母细胞不容易被精子穿透时使用，偶尔作为体外受精的方法，尤其 是与捐精有关的方法。
[001引"测定胚胎质量'是指本发明的方法旨在测定体夕陵精的情况下，胚胎是否有能力 和/或携带遗传崎形或特定序列。本发明的方法允许评估胚胎成功进行W下之一或两者的 能力：赋予高怀孕率和/或产生健康的人。因此，本发明的方法能够结合着床前遗传学检测 和选择能引起怀孕的最佳胚胎。
[0014]术语"有能力的胚胎"（competent emkryo)是指具有导致怀孕的高着床率的胚胎。 术语"高着床率"是指当转移入子宫时，缺少终止该怀孕的程序或事件的情况下，胚胎在子 宫环境着床并产生随后发育成存活后代的存活胎儿的潜力。
[001引如在本文所用，术语"遗传崎形'是指在个体(例如胚胎)基因组中存在的能引起表 型疾病和致死的任何事件。遗传崎形包括但不限于非整倍体、易位、基因/位点扩增、插入、 缺失、逆转、短串联重复序列（STR)多态性、微卫星多态性、单核巧酸多态性(SNP)、引起遗传 病的单个基因突变，或其组合。特别地，根据本方法可W检测任何基因遗传病。例如，基因改 变可W包括在一个或多个基因中的已知改变:CFTR、因子VIIKFS基因）、防朱蛋白、血色病、 G6PD，神经纤维瘤病、GAPDH、的定粉样蛋白和丙酬酸激酶。运些基因的序列和常见突变(例如 单核巧酸多态性或SNP)是已知的。可W检测到其他遗传崎形，例如设及在人染色体中缺失 的、W易位或倒位移动的、或在染色体复制中重复的序列的那些，其中所述序列在胎儿遗传 物质的已知遗传病中被表征。例如，染色体非整倍体，如唐氏综合征(21=体）、爱德华兹综 合征（18S体）、帕陶氏综合征（13S体）、特纳氏综合征(45X0)、克氏综合征(具有2个X染色 体的男性）、普拉德-威利综合征和迪格奥尔格综合征。可W在OMIM数据库中找到已知遗传 崎形的列表化ttp://omim.o;rg/)。
[0016] 本发明的方法优选应用于女性，但理论上也可W应用于其他哺乳动物（例如灵长 类、狗、猫、猪、牛、鼠……)〇
[0017] 如在本文所用，术语"核酸"具有本领域的通常含义，是指编码或非编码的核酸序 列。核酸包括DNA(脱氧核糖核酸）和RNA(核糖核酸）。因此，核酸的实例包括但不限于DNA、 mRNA、tRNA、rRNA、tmRNA、mi RNA、P i RNA、snoRNA 和 snRNA。根据本发明，核酸可来源于胚胎的 核或胚胎的线粒体室。"细胞游离的核酸"是指由胚胎释放的在培养基中存在的核酸，其中 胚胎在体外受精或卵胞浆内单精子注射(ICSI)之后生长。
[0018] 在一个具体的实施方案中，当胚胎达到囊胚期(对应于胚胎发育的第5或6天)时， 制备样品。可W使用本领域公知的任何方法制备其中胚胎在体外受精或卵胞浆内单精子注 射(ICSI)之后生长的培养基样品。本发明的一个必要特征是，在样品制备期间，胚胎保持存 活。不使用裂解酶或基于化学剂的裂解液来维持胚胎的完整性。本发明的方法是完美的无 创方法，其仅基于胚胎能够在培养基中通过尚未确定的机制释放核酸运一事实。
[0019] 本领域技术人员可W使用本领域公知的任何方法从制备的样品中提取游离的细 胞核酸。例如，可W使用在实施例中所述的方法。
[0020] 在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括由W下组成的步骤：i)测定核酸提 取物中的核酸水平，ii)将步骤i)中测定的水平与参考值相比较，和iii)当在步骤i)中测定 的水平低于参考值时，断定胚胎是有能力的。
[0021] 可W通过本领域公知的各种技术来测定核酸水平。在一个具体的实施方案中，可 W进行定量PCR来测定DNA水平，例如在El Messaoudi等，2013;Mouliere等，2013 !!"Iiierry 等，2013和W02012/028746中描述的那些。特别地，可W如实施例所述测定核酸水平。
[0022] 在一个具体的实施方案中，参考值是在胚胎发育第3天在胚胎培养基中测定的核 酸水平。因此，在培养发育第3天和第5或6天(囊胚期)之间水平降低表示胚胎是有能力的。
[0023] 在一个具体的实施方案中，参考值是可W实验上、经验上或理论上确定的阔值或 截止值。也可W基于如本领域普通技术人员将认可的已有的实验和/或临床条件任意选择 阔值。必须确定阔值W获得根据试验功能和收益/风险平衡(假阳性和假阴性的临床结果） 的最佳灵敏性和特异性。通常，可W使用基于实验数据的接受器工作特性(ROC)曲线来测定 最佳灵敏性和特异性（W及阔值）。优选的，本领域技术人员可W将核酸水平(根据本发明的 方法获得)和确定的阔值相比较。在本发明的一个实施方案中，阔值来源于在胚胎培养基中 测定的核酸水平(或比例，或得分），所述培养基源自正在经历IVF或ISCI的一个或多个患 者。此外，在建立运些阔值时也可W使用正在经历IVF或ISCI的患者的适当储存的历史胚胎 培养基中核酸水平(或比例，或得分)的回顾性测量。
[0024] 在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括由W下组成的步骤：i)检测核酸提 取物中的至少一个突变，和ii)当检测到突变时，断定胚胎携带遗传崎形。
[0025] 用于检测核酸，尤其是DNA或mRNA中的突变的一般技术包括但不限于限制性片段 长度多态性、杂交技术、测序、外切酶抗