1,3-丙二醇的生产率得到改善的重组微生物及利用其的1,3-丙二醇的生产方法
【专利摘要】本发明涉及1,3?丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，在具有丙酮酸及乙酰辅酶A的生物合成途径的微生物中，抑制使丙酮酸转化为2,3?丁二醇的途径。并且，本发明涉及利用上述重组微生物来生产1,3?丙二醇的方法。
【专利说明】
1 ,3-丙二醇的生产率得到改善的重组微生物及利用其的1 ,3- 丙二醇的生产方法
技术领域
[0001] 本发明涉及1，3_丙二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的1，3_丙二醇 的生产方法。
【背景技术】
[0002] 作为具有3个碳和两个羟基(-OH)、的醇的一种(CH2OHCH2CH 2Oh)的1，3_丙二醇可用 作聚酯、聚氨酯等高分子的单体，并且，可用作化妆品、个人卫生用品等性质改善用途的添 加剂。尤其，由1,3-丙二醇与对苯二甲酸（terephthalic acid)的聚合反应而生成、且作为 线性的芳香族聚酯的聚对苯二甲酸丙二醇酯(？1'1'4〇1}^1'；[11161：11716116七616。111：1^13七6)在 高分子链上具有发生于半晶体(semi-crystal)分子结构上的所谓扭结(kink)的独特的缠 绕，因此反方弹性及形状稳定性优秀，并且因这种结构特性而可广泛适用于纤维、包装、薄 膜、无纺布结构物、工程塑料等多种领域。
[0003] 1，3_丙二醇可由化学合成和生物合成来进行生产。在化学生产方法中，将环氧乙 烧(ethylene oxide)或丙稀醛(acrolein)来作为原料，由氢化反应而制备的方法，然而存 在所需的费用多、且产生包含环境污染物质的的废物的问题。
[0004] 作为生物合成方法中有借助将来源于玉米的糖用作原料的重组大肠菌发酵的生 产和将甘油等作为原料，并借助1，3-丙二醇生成菌株（I，3-propanediol natural producer)发酵的生产。将玉米等的生物质的糖作为基质来生产I，3-丙二醇的单一微生物 (重组大肠菌）由美国杜邦(DuPont)公司开发而成，并且当前用于商业生产中（W0 2001/ 12833)。另一方面，对于以甘油作为原料来生产1，3_丙二醇的菌株，已从1世纪之前开始公 知，例如，克雷伯氏菌属(Klebsiel la)，肠杆菌(Enterobacter )、梭状杆菌(Clostridium)、 朽1檬酸杆菌(Citrobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)属等。这些菌株通过甘油的还原代谢 途径生产1，3_丙二醇，通过氧化代谢途径提供生长中所需的碳源、能源及生产1，3_丙二醇 时所需的辅酶(NAHD)。
[0005] 作为代表性的1，3_丙二醇生产菌株的克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae) 为革兰氏阴性细菌(G(-))，它不仅对I，3_丙二醇的生产能力突出，而且还对2,3_丁二醇的 生产能力突出。这些特性对以甘油为原料的1，3-丙二醇生产具有局限性，2,3-丁二醇与1， 3_丙二醇具有相似的沸点，因此发生使纯化过程变得难、且降低最终纯化收率的问题。为了 解决上述问题，适用基因重组技术来阻隔甘油代谢途径中生成副产物的氧化代谢途径，并 且制备仅具有生成1，3_丙二醇还原代谢途径的变异体，来试图不生成2,3_ 丁二醇等的氧化 代谢副产物，然而还存在因1，3_丙二醇的生产率降低而难以适用于商用化的情况(韩国特 许申请第 10-2008-0122166号）。
[0006] 为此，本发明人在研究当生产1，3_丙二醇时，包含2,3_丁二醇的氧化代谢副产物 的生成少的重组微生物当中，确认到当在缺失特定基因的重组微生物时，不发生1，3_丙二 醇的生产收率、生产率降低而使副产物的生产降低，并且完成了本发明。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题
[0008] 本发明的目的在于，提供1，3-丙二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的 1，3-丙二醇的生产方法。
[0009] 技术方案
[0010] 为了实现上述目的，本发明提供1，3-丙二醇生产用重组微生物，具有丙酮酸及乙 酰辅酶A的生物合成途径，其特征在于，抑制用于将丙酮酸转化为2,3_ 丁二醇的途径。
[0011] 并且，本发明提供1，3_丙二醇的生产方法，包括:对本发明的重组微生物进行培养 的步骤;以及从上述培养液回收1，3-丙二醇的步骤。
[0012] 有益效果
[0013] 本发明的重组微生物在甘油目标途径中，可抑制作为主要副产物的乳酸、2,3_丁 二醇及甲酸的生成，并且不存在使纯化过程变难的2,3_ 丁二醇的生成，并能够以高选择度 及收率生产1，3_丙二醇。
【附图说明】
[0014] 图1表示作为1，3_丙二醇的生产菌株的克雷伯氏肺炎菌的甘油代谢途径。
[0015] 图2为对存在于克雷伯氏肺炎菌内的与2,3_ 丁二醇合成相关的基因操纵子进行图 式化的图。
[0016] 图3为表示对作为重组克雷伯氏菌株的Kp AldhA ApflB进行分批发酵来生产2， 3_丁二醇的结果(2，3-BD0:2，3-丁二醇，I，3-PD0:1，3-丙二醇）。
[0017]图4为对作为重组克雷伯氏菌株的Kp Δ IdhA ApflB AbudA进行分批发酵来生产 2，3-丁二醇的结果(2，3-BD0:2，3-丁二醇，I，3-PD0:1，3-丙二醇）。
[0018]图5为对作为重组克雷伯氏菌株的Kp AldhA ApflB AbudC进行分批发酵来生 产2，3-丁二醇的结果(2，3-BD0:2，3-丁二醇，I，3-PD0:1，3-丙二醇）。
[0019] 图6为对作为重组克雷伯氏菌株的Kp AldhA ApflB AbudRABC进行分批发酵来 生产2，3-丁二醇的结果(2，3-BD0:2，3-丁二醇，I，3-PD0:1，3-丙二醇）。
【具体实施方式】
[0020] 本发明涉及1，3_丙二醇生产用重组微生物，具有丙酮酸及乙酰辅酶A的生物合成 途径，其特征在于，抑制用于将丙酮酸转化为2，3-丁二醇的途径。
[0021] 并且，本发明涉及1，3_丙二醇的生产方法，包括:对上述重组微生物进行培养的步 骤;以及从上述培养液回收1，3-丙二醇的步骤。
[0022]以下，详细地说明本发明。
[0023] 具有丙酮酸及乙酰辅酶A的生物合成途径的微生物
[0024]本发明的微生物具有丙酮酸及乙酰辅酶A的生物合成途径。本发明的乙酰辅酶A (Acetyl-CoA)的生物合成途径为意味着从微生物内特定代谢产物合成乙酰辅酶A的途径。 本发明的乙酰辅酶A的生物合成途径可以为从丙酮酸(pyruvate)合成乙酰辅酶A的途径等。 本发明的丙酮酸生物合成途径意味着从微生物内特定代谢产物合成丙酮酸的途径。本发明 的丙酮酸生物合成途径可以为从磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合成丙酮酸的途径等。优选地，本发 明的微生物具有从甘油等碳源来生物合成丙酮酸及乙酰辅酶A的途径。
[0025]本发明的具有丙酮酸及乙酰辅酶A的生物合成途径的微生物只要是具有如上所述 的上述生物合成途径的微生物，就不特别限定。并且，本发明的微生物可以为以野生型的方 式具有丙酮酸及乙酰辅酶A生物合成途径的微生物或由基因重组而具有的重组微生物。优 选地，上述微生物为具有1，3_丙二醇的生产率的微生物。上述微生物可选自由克雷伯氏菌 (Klebsiella)属、肠杆菌(Enterobacter)属、乳杆菌(LactobaciIlus)属组成的组中，优选 为克雷伯氏菌属，更优选为克雷伯氏肺炎菌属。
[0026] 1,3-丙二醇生产用重组微生物
[0027]本发明的1，3-丙二醇生产用重组微生物具有如下特征：1，3_丙二醇的生产率、收 率高，当进行发酵时，上述重组微生物与野生型微生物进行比较，发酵液内的1，3_丙二醇的 浓度高。并且，本发明的重组微生物抑制乳酸、甲酸、2,3_丁二醇、丁二酸等的氧化副产物的 生成，尤其抑制因具有与作为目标产物的1，3_丙二醇相似的沸点而使纯化过程变难且降低 最终纯化收率的2,3_ 丁二醇的生成。优选地，本发明的重组微生物不具有甲酸、2,3_ 丁二醇 及丁二酸的生产率。上述甲酸、2,3_ 丁二醇、丁二酸的"无生产率"是意味着实质上不生产它 们，并且意味着无需用于去除甲酸、2,3_ 丁二醇及丁二酸的额外的工序。
[0028] 优选地，本发明的1，3_丙二醇生产用重组微生物具有丙酮酸及乙酰辅酶A的生物 合成途径，抑制用于将丙酮酸转化为2,3_ 丁二醇的途径，更优选地，抑制用于将丙酮酸转化 为2,3_ 丁二醇的途径及用于将丙酮酸转化为乳酸的途径，或抑制用于将丙酮酸转化为2,3_ 丁二醇的途径及用于将丙酮酸转化为甲酸的途径，尤其优选地，用于将丙酮酸转化为2,3_ 丁二醇的途径，用于将丙酮酸转化为乳酸的途径及用于将丙酮酸转化为甲酸的途径均受到 抑制。
[0029] 优选地，以分批培养为基准，本发明的1，3_丙二醇生产用重组微生物的1，3_丙二 醇的收率为〇.40g/g以上，生产率为1.5g/L/小时以上。优选地，当根据下列公式1进行计算 时，本发明的1，3-丙二醇生产用重组微生物的发酵产物内的1，3-丙二醇的比率为80重量百 分比以上，更优选为85重量百分比以上，尤其优选为88重量百分比以上。优选地，本发明的 1，3_丙二醇生产用重组微生物的发酵产物内的乳酸的比率小于5重量百分比，更优选为小 于2重量百分比。优选地，本发明1，3_丙二醇生产用重组微生物的发酵产物内甲酸的比率小 于1重量百分比，更优选为小于0.2重量百分比，尤其优选为小于0.1重量百分比。优选地，本 发明的1，3_丙二醇生产用重组微生物的发酵产物内的2,3_ 丁二醇的比率为小于1重量百分 比，更优选为小于0.2重量百分比，尤其优选为小于0.1重量百分比。优选地，本发明的1，3_ 丙二醇生产用重组微生物的发酵产物内的丁二酸的比率为小于1重量百分比，更优选为小 于0.2重量百分比，尤其优选为小于0.1重量百分比。
[0030] 公式 1
[0031 ]发酵产物内的特定产物的比率={:发酵产物内的特定产物的浓度/(发酵产物内的 1，3-丙二醇、乳酸、甲酸、2，3-丁二醇、乙醇、醋酸及丁二酸的浓度的总和）} X 100 [0032] 抑制用于将丙酮酸转化为213-丁二醇的途径
[0033] 如图1所示，从丙酮酸生产213-丁二醇的微生物具有α-乙酰乳酸合成酶（α-acetolactate synthase)、α-乙酰乳酸脱駿酶（α-acetolactate decarboxylase)、乙偶姻 还原酶(acetoin reductase)等的一连的转化酶组。如下列途径1所示，α-乙酰乳酸合成酶 催化丙酮酸向乙酰乳酸的转化，乙酰乳酸脱羧酶催化乙酰乳酸向乙偶姻的转化，乙 偶姻还原酶催化乙偶姻向2,3_ 丁二醇的转化。
[0034] 途径 1
[0035] 丙酮酸-α-乙酰乳酸(α-acetolactate) -乙偶姻（acetoin)-2，3_ 丁二醇
[0036] 如图2所示，与这些2,3_ 丁二醇合成相关的酶的转录由转录激活因子受到调节，对 多个2,3_ 丁二醇合成酶及转录激活因子进行编码的多个基因，在微生物内基因体上以组成 组的方式存在，并且将它们称为2,3_ 丁二醇操纵子。存在于上述2,3_ 丁二醇操纵子上的多 个酶的抑制可通过各个基因的表达抑制、酶活性抑制等实现。例如，作为用于对2,3_ 丁二醇 操纵子上的酶进行编码的基因的budR(对调节物(regulator)进行编码），budA(ALDC，对α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase)进行编码），budB(ALS，对α-乙酰乳酸合 成酶（α-acetolactate synthetase)进行编码），budC(AR，对乙偶姻还原酶（acetoin reductase)进行编码)之中的一种或一种以上缺失，或在上述基因中引起基因突变(对一部 分碱基进行变异、取代或删除，或导入一部分碱基来抑制正常的基因的表达等基因突变）， 或转录过程或翻译过程中的基因表达调节等，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择 适当的方法来对2，3-丁二醇的合成酶进行抑制。
[0037]优选地，本发明的重组微生物通过抑制α-乙酰乳酸脱羧酶、α-乙酰乳酸合成酶及 乙偶姻还原酶中的一种以上，来抑制用于将丙酮酸转化为2,3_ 丁二醇的途径，更优选地，抑 制α-乙酰乳酸脱羧酶、α-乙酰乳酸合成酶及乙偶姻还原酶，尤其优选地，抑制作为对它们进 行编码、并调节表达的基因的budR、budA、budB及budC的表达。
[0038] 抑制用于将丙酮酸转化为乙酰辅酶A和甲酸的途径
[0039] 丙酮酸甲酸裂解酶(pyruvate-formate lyase)通常在厌氧条件下，催化丙酮酸向 乙酰辅酶A和甲酸的转化(途径2)。
[0040]途径 2
[00411 丙酮酸-乙酰辅酶A+甲酸
[0042] 通过抑制上述丙酮酸甲酸裂解酶，可抑制用于将丙酮酸转化为乙酰辅酶A的途径 及转化为甲酸的途径。上述丙酮酸甲酸裂解酶的抑制可通过丙酮酸甲酸裂解酶的表达抑 制、丙酮酸甲酸裂解酶的酶活性抑制等来实现。例如，使作为对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码 的基因的PflB缺失，或使上述基因中引起基因突变(对一部分碱基进行变异、取代或删除， 或导入一部分碱基来抑制正常的基因的表达等基因突变），或转录过程或翻译过程中的基 因表达调节等，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择适当的方法来对丙酮酸甲酸裂 解酶进行抑制。
[0043] 抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径
[0044] 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase)用于调节丙酮酸向乳酸的转化。通过抑制 上述乳酸脱氢酶，来可抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。上述乳酸脱氢酶的抑制可通 过乳酸脱氢酶的表达抑制、乳酸脱氢酶活性抑制等来实现。例如，使作为对乳酸脱氢酶进行 编码的基因的IdhA缺失，或使上述基因中引起基因突变(对一部分碱基进行变异、取代或删 除，或导入一部分碱基来抑制正常的基因的表达等基因突变），或转录过程或翻译过程中的 基因表达调节等，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择适当的方法来对乳酸脱氢酶 进行抑制。抑制上述途径的本发明的重组微生物的发酵产物内的乳酸的比率小于12重量百 分比，更优选为小于8重量百分比，尤其优选为小于5重量百分比。
[0045] 1,3-丙二醇的生产方法
[0046] 本发明涉及1，3_丙二醇的生产方法，包括:对本发明的重组微生物进行培养的步 骤;以及从上述培养液回收1，3-丙二醇的步骤。
[0047] 上述培养在好氧条件下进行，优选地，在微好氧条件(microaerobic condition) 下进行。例如，当进行培养时，上述培养一边供给氧气，即，供给空气而进行，作为具体的例， 上述培养通过搅拌来实现，但并不局限于此。
[0048] 通过参照详细地叙述的实施例，可明确本发明的优点及特征，及用于实现它们的 方法。然而，本发明不局限于以下公开的实施例，而是以互不相同的多种方式来实现，本实 施例仅用于使本发明的公开完整，并且为了向本发明所属技术领域的普通技术人员完整地 说明发明的范畴而提供，本发明仅由发明要求保护范围的范畴来定义。
[0049] 材料及方法
[0050] -1，3-丙二醇的浓度(g/L):每单位体积生产出的1，3-丙二醇的量
[0051] -1，3_丙二醇的收率(g/g): 1，3_丙二醇的生产量(g)/碳源(g)
[0052] -1,3-丙二醇的生产率(g/L/小时）：每单位时间、单位体积生产的1,3-丙二醇的量 [0053]实验例1:重组微生物的制备
[0054] 克雷伯氏肺炎菌GSC123 AldhA(Kp AldhA)菌株
[0055] 缺失乳酸脱氢酶（IdhA)的克雷伯氏肺炎菌GSC123 AldhA(Kp AldhA)菌株由如 下所述的方法制备。首先，为了克隆克雷伯氏肺炎菌的乳酸脱氢酶，利用SEQ ID NO.3及SEQ IDN0.4的引物对作为靶基因的ldhA(SEQIDN0.1)的同源区域l(SEQIDN0.2)，进行了聚 合酶链式反应(PCR)扩增。并且，利用SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7的引物对同源区域2(SEQ ID NO. 5)进行了聚合酶链式反应扩增。之后，将同源区域1和同源区域2同时作为模板进行 聚合酶链式反应扩增，来完成了同源区域1和同源区域2接合而成的脱氧核糖核酸(DNA)片 段（SEQ ID Ν0·8)(表1)。
[0056]为了提高靶基因的重组概率，上述完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基 因等，为了去除在染色体内重组的抗生素耐性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的 sacB基因。
[0057] 上述制备的脱氧核糖核酸片段利用电穿孔法（electroporation、25uF、200 Ω、 18kV/cm)，向克雷伯氏肺炎菌野生型进行了传递，利用微生物自身具有的同源重组机制，去 除靶基因。
[0058]表1
[0062] 克雷伯氏肺炎菌65(：123&1(11^&口^8(邱&1(11^&口^8)菌株
[0063] 还缺失丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)的克雷伯氏肺炎菌GSC123 AldhA ΔρΠΒ(Κρ AldhA ApflB)菌株由如下所述的方法制备。首先，为了克隆克雷伯氏肺炎菌的丙酮酸甲 酸裂解酶，利用SEQ ID NO. 11及SEQ ID NO. 12的引物对作为靶基因的pflB(SEQ ID NO.9) 的同源区域1(SEQ ID NO. 10)，进行了聚合酶链式反应扩增。并且，利用SEQ ID NO. 14及15 的引物对同源区域2(SEQ ID NO. 13)进行了聚合酶链式反应扩增。之后，将同源区域1和同 源区域2同时作为模板进行聚合酶链式反应扩增，来完成了同源区域1和同源区域2接合而 成的脱氧核糖核酸片段(SEQ ID NO. 16)(表2)。
[0064] 为了提高靶基因的重组概率，上述完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基 因等，为了去除在染色体内重组的抗生素耐性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的 sacB基因。
[0065] 上述制备的脱氧核糖核酸片段利用电穿孔法（electroporation、25uF、200 Ω、 18kV/cm)，向缺失乳酸脱氢酶（IdhA)的克雷伯氏肺炎菌GSC123 Δ IdhA(KpAldhA)菌株进 行了传递，利用微生物自身具有的同源重组机制，去除靶基因。
[0066]表 2
[0070] 在2,3-丁二醇的合成途径上还缺失用于将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻的α-乙酰乳 酸脱駿酶（ a_ace to lac tat e decarboxyl as e，budA)的克雷伯氏肺炎菌GSC123 Δ IdhA Δ pflB AbudA(Kp AldhA ApflB AbudA)菌株由如下所述的方法制备。首先，为了克隆克 雷伯氏肺炎菌的α-乙酰乳酸脱羧酶，利用SEQ ID NO. 19及SEQ ID NO.20的引物对作为靶基 因的budA(SEQIDN0.17)的同源区域l(SEQIDN0.18)，进行了聚合酶链式反应扩增。并 且，利用SEQ ID NO.22及23的引物对同源区域2(SEQ ID NO.21)进行了聚合酶链式反应扩 增。之后，将同源区域1和2同时作为模板进行聚合酶链式反应扩增，来完成了同源区域1和2 接合而成的脱氧核糖核酸片段(SEQ ID NO.24)(表3)。
[0071] 为了提高靶基因的重组概率，上述完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基 因等，为了去除在染色体内重组的抗生素耐性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的 sacB基因。
[0072] 上述制备的脱氧核糖核酸片段利用电穿孔法（electroporation、25uF、200 Ω、 18kV/cm)，向缺失乳酸脱氢酶(IdhA)和丙酮酸甲酸裂解酶(pf 1B)的克雷伯氏肺炎菌GSCl23 AldhA ApflB(Kp AldhA ApflB)菌株进行了传递，利用微生物自身具有的同源重组机 制，去除靶基因。
[0073]表 3
[0076] 克雷伯氏肺炎菌GSC123AldhA ApflB AbudC(KpAldhA ApflB AbudC)菌株
[0077] 在2,3_ 丁二醇的合成途径上还缺失用于使乙偶姻转化为2,3_ 丁二醇的乙偶姻还 原酶(acetoin reductase，budC)的克雷伯氏肺炎菌GSC123 AldhA ApflB AbudC(Kp Δ IdhA ApflB AbudC)菌株由如下所述的方法制备。首先，为了克隆克雷伯氏肺炎菌的乙偶 姻还原酶，利用SEQ ID NO.27及28的引物对作为靶基因的budC(SEQ ID NO.25)的同源区域 1(SEQ ID NO.26)，进行了聚合酶链式反应扩增。并且，利用SEQ ID NO.30及31的引物对同 源区域2(SEQ ID NO.29)进行了聚合酶链式反应扩增。之后，将同源区域1和同源区域2同时 作为模板进行聚合酶链式反应扩增，来完成了同源区域1和同源区域2接合而成的脱氧核糖 核酸片段(SEQ ID NO.32)(表4)。
[0078] 为了提高靶基因的重组概率，上述完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基 因等，为了去除在染色体内重组的抗生素耐性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的 sacB基因。
[0079] 上述制备的脱氧核糖核酸片段利用电穿孔法（electroporation、25uF、200 Ω、 18kV/cm)，向缺失乳酸脱氢酶(IdhA)和丙酮酸甲酸裂解酶(pf 1B)的克雷伯氏肺炎菌GSCl23 AldhA ApflB(Kp AldhA ApflB)菌株进行了传递，利用微生物自身具有的同源重组机 制，去除靶基因。
[0080] 表 4
[0083] 克雷伯氏肺炎菌GSC123 AldhA ApflB A budRABC(Kp AldhA ApflBA budRABC)菌株
[0084] 还缺失构成2,3_丁二醇操纵子的基因（budRABC)，即，转录激活因子(budR)、a-乙 酰乳酸脱羧酶(budA)、a-乙酰乳酸合成酶(budB)及乙偶姻还原酶(budC)的克雷伯氏肺炎菌 GSC123 AldhA ApflB AbudRABC(Kp AldhA ApflB AbudRABC)菌株由如下所述的方法 制备。首先，为了克隆克雷伯氏肺炎菌的2,3_丁二醇操纵子，利用SEQ ID NO.35及SEQ ID N0.36的引物对作为靶基因的budRABC(SEQIDN0.33)的同源区域l(SEQIDN0.34)进行了 聚合酶链式反应扩增。并且，利用SEQ ID NO.38及SEQ ID NO.39对同源区域2(SEQ ID NO.37)的引物进行了聚合酶链式反应扩增。之后，将同源区域1和同源区域2同时作为模板 进行聚合酶链式反应扩增，来完成了同源区域1和同源区域2接合而成的脱氧核糖核酸片段 (SEQ ID Ν0·40)(表5)。
[0085] 为了提高靶基因的重组概率，上述完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐性基 因等，为了去除在染色体内重组的抗生素耐性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的 sacB基因。
[0086] 上述制备的脱氧核糖核酸片段利用电穿孔法（electroporation、25uF、200 Ω、 18kV/cm)，向缺失乳酸脱氢酶(IdhA)和丙酮酸甲酸裂解酶(pf 1B)的克雷伯氏肺炎菌GSCl23 AldhA ApflB(Kp AldhA ApflB)菌株传递，利用微生物自身具有的同源重组机制，去除 靶基因。
[0087]表 5
[0095] 实验例2:1,3-丙二醇的生产
[0096] 对在上述实验例1中制备的重组菌株进行培养来生产了 1，3_丙二醇。此时，作为比 较例，使用了野生型克雷伯氏肺炎菌GSC123(Kp wt)。
[0097] 将各重组菌株接种于250ml的复合培养基，并且在37°C温度下进行16小时的培养 之后，将上述培养液接种于3L复合培养基中。此时，发酵条件为微好氧条件(micro-aerobic condition ;呼气流速：Ivvm、搅拌速度：200rpm)，且设定46g/L的甘油（500mM的甘油 (glycerol ))、酸碱度(pH)为7.0及培养温度为37°C。发酵当中为了调节酸碱度而使用了氨 (NH3)。对上述重组克雷伯氏菌采集了发酵中的样品，并且通过测定采集的试样的光密度值 0D600(optical density)来测定了生长速度在13000rpm条件下，对采集的试样进行离心分 离10分钟之后，利用高效液相色谱分析法(HPLC)分析了上层液的代谢产物及1，3_丙二醇的 浓度。
[0098] 其结果，缺失IdhA的重组菌株(Kp AldhA)作为野生型克雷伯氏肺炎菌(Kp wt)的 最多的副产物的乳酸显著减少了。然而，作为其他副产物的甲酸、2,3_丁二醇、乙醇、醋酸、 丁二酸均增加，最终1，3_丙二醇的生产浓度及生产收率反而减少了。并且，在同时缺失IdhA 和pf IB的重组菌株(Κρ Δ IdhAA pf 1B)的情况下，与作为上述野生型克雷伯氏肺炎菌株的Kp wt或缺失IdhA的作为克雷伯氏肺炎菌株的Kp Δ IdhA进行比较时，除了2，3-丁二醇之外的所 有副产物大幅减少了，并且最终1，3-丙二醇生产浓度及生产收率增加了。然而，2，3_丁二醇 的浓度增加相当多。
[0099]与除去与2，3_丁二醇的合成相关的酶组之中的一部分的重组菌株，即，与Kp Δ IdhA ApflB AbudA或Kp AldhA ApflB AbudC进行比较时，在作为缺失整个2，3_丁二 醇操纵子的重组菌株的Kp AldhA ApflB AbudRABC的情况中，可取得最高的1，3_丙二醇 的浓度和最低的副产物生产，在生产收率及生产率侧面中，也可取得最优秀的结果。另一方 面，用于减少2,3_丁二醇的积累的缺失基因中，在使budA缺失的情况下，使(Kp AldhA Δ pflB AbudA)和budRABC缺失的情况(Kp AldhA ApflB AbudRABC)产生了效果，然而，在 使budC缺失的情况下(Kp AldhAApflB AbudC)未产生效果，在缺失budA的重组菌株(Kp Δ IdhA ApflB AbudA)的情况下，发酵性能不良，因此发酵结束时间点的24小时之后还观 察到了残留甘油。然而，在缺失budRABC的重组菌株(Kp AldhA ApflB AbudRABC)的情况 下，呈现出了与某菌株(Kp AldhA ApflB)相似的发酵模式，并且未生产出2,3_丁二醇(表 7及表8、图3至图6)。
[0100]表7
[0104] 工业实用性
[0105] 本发明涉及1，3-丙二醇生产用重组微生物，具有丙酮酸及乙酰辅酶A的生物合成 途径，其特征在于，抑制用于将丙酮酸转化为2,3_ 丁二醇的途径。并且，本发明涉及利用上 述重组微生物来生产1,3-丙二醇的方法。
[0106] 序列表自由内容(Free Text)
[0107] SEQ ID N0.1 为IdhA的基因序列。SEQ ID N0.2为IdhA的同源区域 1，SEQ ID N0.3 及SEQ ID NO.4为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO.5为IdhA的同源区域2， SEQ ID NO.6及SEQ ID NO.7为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO.8为IdhA 的同源区域1和同源区域2接合而成的脱氧核糖核酸片段。
[0108] SEQ ID N0.9为PflB的基因序列。SEQ ID NO. 10为PflB的同源区域 1，SEQ ID NO. 11及SEQ ID NO. 12为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO. 13为pf IB的同 源区域2，SEQ ID NO. 14及SEQ ID NO. 15为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO. 16为pflB的同源区域1和同源区域2接合而成的脱氧核糖核酸片段。
[0109] SEQIDN0·17为budA的基因序列。SEQIDN0·18为budA的同源区域l，SEQID NO. 19及SEQ ID NO. 20为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO. 21为budA的同 源区域2，SEQ ID NO.22及SEQ ID NO.23为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO.24为budA的同源区域1和同源区域2接合而成的脱氧核糖核酸片段。
[0110] SEQ ID N0.25为budC的基因序列。SEQ ID N0.26为budC的同源区域 1，SEQ ID NO. 27及SEQ ID NO. 28为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO. 29为budC的同 源区域2，SEQ ID NO.30及SEQ ID NO.31为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO.32为budC的同源区域1和同源区域2接合而成的脱氧核糖核酸片段。
[0111] SEQ ID N0.33为budRABC的基因序列。SEQ ID N0.34为budRABC的同源区域 1，SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36为用于其的聚合酶链式反应扩增的引物。SEQ ID NO.37为 budRABC的同源区域2,SEQ ID NO.38及SEQ ID NO.39为用于其的聚合酶链式反应扩增的引 物。SEQ ID NO.40为budRABC的同源区域1和同源区域2接合而成的脱氧核糖核酸片段。
【主权项】
1. 一种1，3-丙二醇生产用重组微生物，具有丙酮酸及乙酰辅酶A生物合成途径，其特征 在于，抑制用于将丙酮酸转化为2,3_ 丁二醇的途径。2. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，通过抑制α-乙酰 乳酸脱羧酶、乙酰乳酸合成酶及乙偶姻还原酶中的一种以上，来抑制用于将丙酮酸转化 为2,3_ 丁二醇的途径。3. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，通过抑制α-乙酰 乳酸脱羧酶、乙酰乳酸合成酶及乙偶姻还原酶，来抑制用于将丙酮酸转化为2,3_ 丁二醇 的途径。4. 根据权利要求1所述的1，3-丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制具有SEQ ID NO. 33的碱基序列的基因。5. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制甲酸的生 成。6. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制2,3_ 丁二醇 的生成。7. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，抑制丁二酸的生 成。8. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，还抑制用于将丙 酮酸转化为乳酸的途径。9. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，还抑制乳酸脱氢 酶。10. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，还抑制用于将 丙酮酸转化为甲酸的途径。11. 根据权利要求1所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，还抑制丙酮酸 甲酸裂解酶。12. 根据权利要求8所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，还抑制用于将 丙酮酸转化为甲酸的途径。13. 根据权利要求8所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物，其特征在于，还抑制丙酮酸 甲酸裂解酶。14. 一种1，3-丙二醇的生产方法，其特征在于，包括： 对权利要求1至13中任一项所述的1，3_丙二醇生产用重组微生物进行培养的步骤；以 及 从所述培养物回收1，3-丙二醇的步骤。
【文档编号】C12N1/21GK105829523SQ201480068693
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月16日
【发明人】梁宅镐, 切拉杜拉尔·拉斯纳西
【申请人】Gs加德士