一种醇脱氢酶及其基因、重组酶和合成手性双芳基仲醇的应用
【专利摘要】本发明公开了一种醇脱氢酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶以及该酶作为催化剂在不对称还原合成手性双芳基仲醇中的应用，属于生物工程技术领域。本发明的醇脱氢酶来源于克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.CCTCCM2011385)，不仅具备还原羰基的功能，而且具备氧化羟基的功能。应用所述醇脱氢酶作为生物催化剂不对称还原双芳基酮为手性双芳基醇时，不需要额外添加如葡萄糖脱氢酶等用于辅因子循环的酶，催化效率高，反应条件温和，易于产物回收，成本低，因此在抗组胺药物的生产中具有很好的应用开发前景。
【专利说明】
一种醇脱氢酶及其基因、重组酶和合成手性双芳基仲醇的 应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于克鲁维酵母的醇脱氢酶及其 基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方 法，以及该重组酶作为催化剂在不对称还原制备光学双芳基仲醇中的应用。
【背景技术】
[0002] 手性双芳基仲醇是一类重要的手性化合物，许多药物的分子结构中都存在着双芳 基仲醇的砌块结构，其中手性(4-氯苯基)_(吡啶-2-基)_甲醇可用于合成抗过敏药贝他司 汀。由潜手性双芳基酮经不对称还原反应合成手性双芳基醇的工艺具有原子经济性高的优 点。
[0003] 化学不对称还原法主要由以下三种技术实现：
[0004] 1.以（4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲酮(CPMK)为原料，（S)-[Ru(BINAP)Cl2]2(NEt 3) 为催化剂，加压，通氢气，还原得到（S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇（（S)-CPMA)。（赵志 全等·中国医药工业杂志· 2006 · 37，726-727)
[0005] 2.以CPMK为原料，采用三步反应，1)先用三氟甲烷磺酸酐等进行保护，2)再用催化 剂钯配位体及Me-CBS等还原羰基得到S构型羟基，3)在三苯基膦钯等作用下脱保护，得到 ⑶-CPMA。
[0006] 3.以CPMK为原料，以手性BINAL-H为手性还原剂，定向合成单一构型CPMAJ)
[0007] 但是上述反应所需的贵金属配位体较难购买，成本较高，反应需要高压条件，操作 步骤较多。因而不利于工业化生产。（CN103121966A)
[0008] 生物不对称还原法主要由以下四种技术实现：
[0009] 1. 2007年，Truppo等筛选了一系列商品化酮还原酶KRED后，发现虽然有一些酮还 原酶对双芳基底物有还原能力，但立体选择性一般，且底物谱较窄，底物中的取代基团对立 体选择性的影响较大。仅KRED124可以不对称还原CPMK生成(R)-CPMA，ee值为94%，转化率 98%，且需要外源葡萄糖脱氢酶提供辅酶循环。（Org. Lett .，2007，9，335-338.)
[0010] 2· 2009年，朱敦明等发现来源于Sporobolomyces salmonicolor的重组羰基还原 酶SsCR及其突变体可以立体选择性还原不同双芳基酮底物(8-99%ee)。在葡萄糖脱氢酶的 协助下，还原CPMK生成（R)-CPMA，转化率62 %，对映选择性为88 % (R)。（Org · Lett ·，2008， 10,525-528.)
[0011] 3. 2012年，周婕妤等通过传统富集培养筛选到一株克鲁维酵母Kluyveromyces sp.CCTCCM2011385,可催化还原CPMK生成（3)-0?]\^(87%66)。然而活性酶在野生菌中的含 量低，最高仅能催化2g · I/1底物，产物浓度较低，分离成本高，因而不能满足应用的需要。 (Process Biochem.,2012,47,1042-1048.；CN102559520A)
[0012] 4. 2013年，李哲等研究了一个来源于来源于毕赤酵母GS115的羰基还原酶PasCR 对lOmmol · I/1的一系列双芳香基甲酮类化合物的不对称还原，转化率最高只有50%。（生物 工程学报，2013,29,68-77)
[0013] 由以上数据可知采用生物不对称还原法制备手性(4'_氯苯基)_(吡啶-2'-基)_甲 醇的产率低，提取困难，并且立体选择性均达不到工业化要求，需要进一步开发高效羰基还 原酶。本发明提供了一种醇脱氢酶，可以高效不对称还原1_(4'_氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲 酮生成(R)_(4'_氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲醇，该反应具有不需外源添加昂贵辅酶，不需额 外添加如葡萄糖脱氢酶等用以辅因子循环的酶，反应条件条件温和，操作简单等优点。
【发明内容】
[0014] 本发明要解决的技术问题是针对以克鲁维酵母（Kluy veromy ce s sp .) CCTCCM2011385作为CPMK不对称还原催化剂时酶产量较低使总体催化活性不高，不对称还 原底物谱较窄的缺陷，而提供一种具有优异的不对称催化活性、底物适用性广、对环境友好 的的醇脱氢酶及其编码基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，重组酶 的制备方法，以及该在制备手性双芳基醇的应用。
[0015] 本发明所采取的技术方案之一是:一种分离的核酸，所述的核酸是编码醇脱氢酶 的核酸分子。
[0016] 其中醇脱氢酶的编码基因来源于克鲁维酵母（Kluyveromyces sp.) CCTCCM2011385,命名为kpadh，其编码序列如SEQ ID N0.1所示；或编码由序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；以及任何对SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行一个 或多个核苷酸的取代、插入或缺失处理获得的核苷酸序列，可编码出具有醇脱氢酶活性的 蛋白质。基因全长为l〇29bp，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1029个碱基止，起始密码 子为ATG，终止密码子为TAA，序列内无内含子。
[0017] 其中所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括:从 自然界中提取天然存在的编码醇脱氢酶的核酸分子，通过基因克隆技术获得编码醇脱氢酶 编码基因的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码醇脱氢酶的核酸分子。
[0018] 本发明所采取的技术方案之二:一种分离的蛋白质，所述蛋白质具有双芳基醇脱 氢酶的活性。
[0019] 其中醇脱氢酶，命名为KpADH，氨基酸序列为SEQIDN0.2所示；及任何对SEQID N0.2所示氨基酸序列中氨基酸进行插入、缺失或替换的处理获得的多肽片段或其突变体， 只要其保持醇脱氢酶的催化活性的蛋白质。
[0020] 本发明所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为： 将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到 转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，经镍柱亲和层析分离纯化 获得所述蛋白质。
[0021] 所述的醇脱氢酶KpADH是NADPH依赖的，分子量大小为90~100kDa，是同源二聚体； 该酶可以催化还原双芳基酮底物，且可以氧化异丙醇以实现辅酶再生；该醇脱氢酶还原 CPMK的最适反应pH为5.5，氧化异丙醇的最适反应pH为9.5;最适反应温度为50°C ;该酶对 〇卩]\0(、祖0?!1、异丙醇和祖0?+的1^*/1^分别为129,601，8.70和63.48- 1.111]?-1;该酶不依赖于 金属离子发挥催化功能。
[0022]本发明所采取的技术方案之三：一种包含技术方案之一所述核酸的重组表达载 体。
[0023] 其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的醇脱氢 酶基因的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种 载体。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，本发明所述载体优选地为 pET28a(+)。
[0024] 本发明采取的技术方案之四是:一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。 [0025]其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为:将上述重组表达载体转化至宿主 微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足上 述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的醇脱氢酶基因可被有效表达即可。其中所述 宿主微生物较佳地为:大肠杆菌(Escherichia coli)，更加的为大肠杆菌BL21(DE3)将前述 重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述 转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
[0026]本发明所采取的技术方案之五是:一种重组醇脱氢酶的制备方法，其中包括如下 步骤:培养上述的重组表达转化体，从培养物种获得重组醇脱氢酶。
[0027]其中所述制备方法较佳地为：将上述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素（50yg/ mL)的LB培养基中，30~40°C，150~200rpm培养，培养液的吸光密度0D6Q()达到0.5~1.0(优 选0 · 8)，加入0 · 05~1 · Ommol/L(优选地为0 · 2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)进行诱导，诱导温度为20~30°C (优选30°C)，诱导6~12小时即可得到高效表达的重 组醇脱氢酶。离心收集菌体并细胞破碎获得粗酶液，再用镍柱进行纯化，获得重组醇脱氢酶 纯酶。
[0028]本发明所采取的技术方法之六是:上述蛋白质或上述重组表达转化体作为催化剂 在手性双芳基醇化合物合成中的应用。
[0029] 较佳的，所述的应用按下述方法进行:CPMK的浓度为10~500mmo 1 /L;所述的重组 醇脱氢酶的用量为1~10kU/L(酶活定义见实施例1);异丙醇的用量为20~1000mm〇l/L;所 述的NADP+的用量为0· 1~1 ·0mm〇l/L;所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0· lmol/L，pH 6~8;所 述的不对称还原反应的温度为20~35°C;所述的不对称还原反应的时间以反应完全为准， 一般为1~12小时。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(R) -CPMA 产物。
[0030] 反应过程中取样检测：取100yL反应液，加入500yL乙酸乙酯，震荡1~2min， 12000rpm离心2~5min，取上清到离心管中，待有机相自然会发完全，加入500yL分析纯的乙 醇，进行液相分析转化率和ee值，具体条件如：Daicel Chiralcel 0Β-Η(5μηι，250mm X 4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烷：乙醇：乙醇胺(90:10:0.01，V/V/V)，流速lmL/min，柱 温30°C，紫外检测波长254nm，进样量10yL，保留时间：（S)-(4'_氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲 醇8.6711^11，（1〇-(4'-氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲醇9.371^11。
[0031 ] 产物光学纯度通过对映体过量值(ee)来评价：
[0032] Ar :液相色谱分析获得的(R)-CPMA摩尔浓度;As:液相色谱分析获得的⑶-CPMA的 摩尔浓度。
[0033]在符合本领域尝试的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0034]本发明所用试剂盒原料均市售可得。
[0035]本发明的有益效果：本发明重组表达的可溶性KpADH酶具有表达水平高、酶活力 高、双功能（具有底物偶联的辅因子循环系统)等优点，可用于高效制备(R)_(4'_氯苯基)-(吡啶-2基)-甲醇等目前生物手性催化难以制备的手性双芳基仲醇，原子经济性高，制备 方法简单，反应条件温和，低耗能，对环境友好，副反应少，只需一步还原即可完成。
【附图说明】
[0036] 图1 KpADH基因的PCR扩增电泳图谱。M:Marker;l:KpADH基因 [0037] 图2重组表达质粒pET28-KpADH的构建示意图。
[0038] 图3重组醇脱氢酶KpADH的蛋白电泳图。M，Marker;泳道1和2分别为大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a-KpADH诱导后细胞破碎上清和沉淀部分。
[0039] 图4醇脱氢酶催化还原1_(4'_氯苯基）_(吡啶_2'_基）_甲酮生成（R)_(4'_氯苯 基)_(吡啶_2'_基)_甲醇示意图。
[0040] 图5分离纯化后的产物(R)-CPMA的HPLC图谱。 具体实施方案
[0041] 下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护 范围。
[0042] 除非另有注明具体条件，各实施例中的试验方法均按照常规方法和条件或按照试 剂说明书进行。除非另有明确标注，各组分的含量均以质量/体积(w/v)含量表示。表达质粒 pET28a购于上海Novagen公司。E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2XTaq PCR Master Mix，琼 脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。
[0043]实施例1醇脱氢酶基因的克隆
[0044]采用鸟枪法克隆上述克鲁维酵母的醇脱氢酶基因。
[0045] (1)首先使用LB培养基，于37°C下过夜培养上述克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.) CCTCCM2011385。离心获得菌体后，使用常规酵母基因组提取试剂盒获得基因组总DNA。 [0046] (2)使用限制性内切酶Sau3AI酶切总DNA，形成GATC黏性末端。通过控制酶用量和 反应时间，把总DNA酶切成2~6kb的片段并进行回收。将这些片段与BamH I (识别序列 GGATCC，黏性末端GATC)酶切的pET28a质粒进行连接，连接产物转化入感受态细胞E.coli BL21((DE3)后，涂布在含有50m g//L卡那霉素的LB固体平板上，于37°C培养12~16h后，挑取 单菌落进行下一步活性筛选。
[0047] (3)挑单菌落接种至LB固体培养基平板上以进行保存，随后接种至96孔深孔板培 养，待0D6QQ达到0.6~0.8时，加入0.2mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)，30°C诱导培 养12小时后，离心收集细胞。然后用pH 7.0的缓冲液悬浮所得细胞，加入溶菌酶进行细胞破 碎后离心，收取上清液，加入甘油至终浓度为20%即为粗酶液，于-80°C保存备用。使用分光 光度计检测340nm处吸光值的变化，酶活力单位(U)定义为每分钟催化Ιμπιο? NAD(P)H氧化 或者每分钟催化lymol NAD(P)+还原所需要的酶量。发现有一个重组菌体的粗酶液对底物 双乙酰有活性(依赖于辅酶NADH)。
[0048] (4)由上海赛音生物技术有限公司对所得阳性克隆子中所插入的外源片段进行测 序。测序结果表明，外源片段长度为1738bp，利用ORF Finder在线预测开放阅读框，发现其 中500~1300bp的开放阅读框只有一个。
[0049] (5)以鸟枪法所得到的开放阅读框为依据，设计引物如下：
[0050] 上游引物：5'-GGAATTCCATATGAGCGTATTAATTAGTGG-3'，如SEQ ID Νο·3所示，在5' 端加上Nde頂每切位点；
[0051] 下游引物：5'-CGCGGATCCTTAAACTCTACCTTCTTTAT-3'，如SEQ ID No.4所示，在5'端 加上BamH I酶切位点；
[0052] 以克鲁维酵母的基因组为模板进行PCR，体系如下(yL):10XPCR Mix 10,上游引 物0.2,下游引物0.2,基因组0.2，DNA聚合酶0.2，ddH20 9.2JCR程序为:95°C预变性lOmin， 95°C裂解30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，循环29次，72°C延伸lOmiruPCR产物经琼脂糖凝 胶电泳纯化，并利用琼脂糖胶回收试剂盒回收800~1200bp区间的条带（图1)，即醇脱氢酶 基因。所得醇脱氢酶基因命名为kpadh，核苷酸序列如SEQ ID No.l所示:全长1029bp，其起 始密码子为ATG，终止密码子为TAA。序列中无内含子，编码序列从第1个核苷酸起至1029个 核苷酸止，所编码的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。序列已登录至NCBI数据库，登录号 KP872638。
[0053] 实施例2重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-kpadh的构建及培养
[0054] 将实施例1回收的基因 kpadh与质粒pET28a分别用限制性内切酶Ndel和BamH I于 37°C水浴中过夜双酶切，次日经琼脂糖凝胶电泳纯化并利用琼脂糖回收试剂盒回收目标片 段。4°C下，使用T4DNA连接酶过夜连接酶切过的基因 kpadh与质粒pET28a，即得重组表达载 体pET28a-kpadh(图2)。将构建好的重组表达载体pET28a-kpadh热转入大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态中，涂布Kan抗性LB固体平板，过夜培养后进行菌落PCR验证，阳性克隆子即为重组大 肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-kpadh。挑取阳性克隆子于LB培养基中过夜培养，次日按2%转接 量转接入新鲜LB培养中，培养至0D 6qq达到0.6~0.8时，加入0.2mM IPTG，30°C诱导培养6小 时后，4°C、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于磷酸钾缓冲液（100mM，pH 6.0)中，超声破碎，并通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况（图3)。由图3可知，上清液中目标 位置有蛋白可溶高表达，说明重组醇脱氢酶在大肠杆菌中得到成功表达。
[0055]实施例3醇脱氢酶的分离纯化
[0056] 悬浮培养好的重组细胞于A液(20mmol · L-1憐酸纳，500mmol · L-SaCl，20mmol · L 4咪唑，pH 7.4)中，超声波破碎离心后获得粗酶液。纯化所使用的柱子为亲和柱HisTrap FF crude(镍柱），利用重组蛋白上的组氨酸标签进行亲和结合来完成。首先使用A液将镍柱平 衡，粗酶液上样，继续使用A液将穿透峰洗脱下来，待平衡后用B液（20mmol · I/1磷酸钠， 500111111〇1.1/1恥(：1，1000111111〇1.1/ 1咪唑，？!17.4)进行梯度洗脱，将结合到镍柱上的重组蛋 白洗脱下来，获得重组醇脱氢酶。对纯化后的蛋白进行酶活测定（CPMK为底物，NADPH为辅 酶)及SDS-PAGE分析。纯化各项参数如表1。镍柱纯化后，在45kDa左右显示单条带，且杂蛋白 较少，说明镍柱纯化效果较好。之后使用HiTrap Desalting脱盐柱(GE Healthcare)将纯化 后的醇脱氢酶置换到TriS-HCl(100mm〇l · L'pH 7.0)缓冲液中，进行下一步酶学性质分 析。
[0057]表1蛋白纯化后酶活测定
[0058]
[0059] 实施例4蛋白质分子量确定
[0000] 使用Superdex? 200分子排阻柱(GE Healthcare)进行蛋白质分子量测定。柱子用 Tris-HCl缓冲液（lOOmmol · L-SpH 7.0)平衡后，将0.5mL蛋白样品上样，然后继续用Tris-HC1缓冲液进行洗脱，观察醇脱氢酶KpADH出峰时的洗脱体积。根据标准蛋白（抑肽酶 6.5kDa，核糖核酸酶A 13.7kDa，β-乳球蛋白35kDa，牛血清白蛋白67kDa，铁蛋白440kDa)洗 脱曲线计算出醇脱氢酶KpADH的分子量。计算可知，脱氢酶KpADH的蛋白大小为90~90kDa， 说明KpADH为同源二聚体。
[0061]实施例5底物谱分析
[0062]醇脱氢酶的酶活力单位1U定义为:在一定条件下，每分钟催化氧化Ιμπιο? NAD(P)H 或每还原lymol NADP+所需要的酶量。
[0063] (1)还原活力测定方法：总反应体系为200yL，包括:0.5mmol · L-iNADPHAmmol · L 1同类底物，磷酸钠缓冲液(PBS，100mmol · L'pH 5.5)，充分混匀，30°(：保温21^11，加入适 量的酶液，检测340nm下吸收值的变化。
[0064] (2)氧化活力测定方法:总反应体系为200yL，包括:5mmol · L-iNADP+aOmmol · L一1 醇类底物，磷酸钠缓冲液(PBS，100mmol · L'pH 9.5)，充分混均，30°(：保温21^11，加入适量 的酶液，检测340nm下吸收值的变化。
[0065]测定KpADH还原多种潜手性酮类底物及氧化多种醇类底物的酶活力。分别以CPMK 及异丙醇为底物测得的酶活力为100%对照，其他底物测得的酶活力以二者的百分比计算。 测定结果如表2所示。
[0066]表2醇脱氢酶KpADH的底物特异性
[0068] 对于芳基酮类底物，KpADH对CPMK和苯乙酮均表现出较高的还原活力（100 %和 56.4% )，这类底物位阻大，在水中溶解度低，与羰基还原酶的天然底物性质相差较大，对此 类底物有高的催化活性的酶较少。对比二苯甲酮，苄基苯乙酮和3,4_二氯二苯甲酮发现，随 着空间位阻的进一步增大，KpADH的催化活性逐渐降低。对于2,3_戊二酮、2,4_戊二酮、2,3_ 己二酮、3,4-己二酮和2,5-己二酮等二酮类底物，KpADH更易于还原2,4-戊二酮(74.6%相 对活力hKpADH对酮酯类底物的活力较高，对2-氧-4-苯基丁酸乙酯和乙酰乙酸乙酯的还原 活力可高达是CPMK的24倍左右。对于氧化反应的底物特异性，除了 2，3-丁二醇外，相对活力 均小于10%。邱40!1氧化2,3-丁二醇的活力是氧化异丙醇活力的3.6倍，表明2,3-丁二醇可 作为用于辅因子再生的潜在辅底物。
[0069] 实施例6最适反应pH
[0070]配制lOOmmol · L-1不同pH的缓冲液:梓檬酸钠缓冲液(pH 4.0~6.0)、磷酸钠缓冲 液(pH 6.0~8.0)、甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 8.0~12.0)。然后分别以CPMK及异丙醇为底物， 测定KpADH在不同pH缓冲液中的酶活力。最高酶活力定为100 %，其他pH下测得的酶活力以 相对于最高活力的百分比计算。结果分析所示，氧化活力的最适pH为9.5,还原活力的最适 pH为5.5。
[0071 ]实施例7最适反应温度
[0072] 分别以CPMK及异丙醇为底物，测定KpADH在不同温度(4~46°C)下的酶活，测得的 最高酶活定为100%，其他温度下测得的酶活以相对于最高活力的百分比计算。结果分析显 示，KpADH的最适温度为50 °C。
[0073]实施例8动力学参数分析
[0074]测定KpADH在不同底物浓度和辅酶浓度情况下的活力，并根据活力和底物浓度的 倒数做出双倒数曲线，计算动力学参数。
[0075] 表3醇脱氢酶KpADH的动力学参数
[0077]由表3可知，该酶对CPMK的亲和力(Km = 0.500mmol · I/1)高于对异丙醇的亲和力 (Km = 6.36mmol · L-且还原CPMK的速率(1^ = 64.78+1)高于氧化异丙醇的速率(kcat = 55.3s-因此KpADH对CPMK的底物专一性常数kcat/Km(129L · s -1 · mmol - 1)高于异丙醇 (8 · 69L · s-1 · mmol-1)。
[0078]实施例9金属离子和添加剂对酶活力的影响
[0079] 将终浓度为lmmol · I/1的氯化盐或者硫酸盐形式的金属离子加入到纯化后酶液 中，于30°C下温育30min后，在Tris-HCl缓冲液（lOOmmol · L-SpH 7.0)中以CPMK和异丙醇为 底物测定其残余酶活。同等条件下，不加任何金属离子测得的酶活定为100%对照，加入金 属离子测得的酶活以对照的百分比计算。结果如表4所示。
[0080] 表4金属离子及添加剂对KpADH的还原和氧化活力的影响
[0082]没有发现具有显著激活KpADH的氧化和还原活力的金属离子。Mg2+、Ba2+、Ca 2+、Mn2+、 Li+等离子对KpADH的还原和氧化活力的有轻微的激活作用，相对还原和氧化活力分别约为 110%和120%;2112+^1 3+、(：112+^82+、？62+等离子对邱40!1的氧化和还原活力都具有严重的抑 制作用。EDTA的添加并没有使酶活力降低，从另一方面说明KpADH不是金属离子依赖性酶。 蛋白变性剂SDS的添加导致酶解聚成单体，而单体仅保留有8%的相对活力，说明KpADH的活 性依赖于多聚体。吐温20、DTT、i3-巯基乙醇的添加可在一定程度上促进KpADH的氧化和还原 活力。
[0083]实施例9醇脱氢酶KpADH不对称还原潜手性双芳基酮的转化率及选择性分析 [0084] 测定醇脱氢酶KpADH不对称还原不同潜手性双芳基酮的效果，其中底物浓度为为 10mm〇l/L，重组醇脱氢酶的用量为100U/L(酶活定义见实施例1)，异丙醇的用量为20mmol/ L;NADP+的用量为0.1mmol/L，磷酸盐缓冲液的浓度为lOOmmol · L-SpH 7.0。不对称还原反 应的温度为30°C，反应12小时。转化率及选择性分析方法如下：取100yL反应液，加入500yL 乙酸乙酯，震荡1~2min，12000rpm离心2~5min，取上清到离心管中，待有机相自然会发完 全，加入500yL分析纯的乙醇，进行液相分析转化率和ee值，具体条件如:Daicel Chiralcel 0Β-Η(5μπι，250mm X 4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烷：乙醇：乙醇胺(90 :10:0.01，V/V/ V)，流速lmL/min，柱温30°C，紫外检测波长254nm，进样量10yL。结果如表5所示。
[0085] 表5醇脱氢酶KpADH不对称还原双芳基酮底物的转化率及选择性分析
[0088] 由表5可知，醇脱氢酶KpADH可不对称还原多种潜手性双芳基酮，转化率为35~ 99%，立体选择性82.3~90.1%。
[0089] 实施例10醇脱氢酶KpADH在不同pH条件下不对称还原CPMK
[0090] 于2ml磷酸钠缓冲液（lOOmmol · L-SpH 6·0、ρΗ 7·0、ρΗ 8.0)中加入实施例一所得 的菌体lg/L，500mmol · L-1的CPMK(溶解于异丙醇)500yL，在30°C，200rpm反应12h。液相色谱 分析转化率，如表6所示。
[0091] 表6缓冲液pH对CPMK不对称还原的影响
[0093] 从表6可以看出，反应体系的pH值对醇脱氢酶KpADH不对称还原CPMK的转化率有显 著影响，在pH 7.0时转化率最高。
[0094] 实施例11-18重组菌催化KpADH不对称还原反应的条件优化 [0095] 取10~100U所得的重组醇脱氢酶KpADH于磷酸盐缓冲液(pH 7.0，100mmol · L-1) 中，加入CPMK 0 · 1~5mmol，0~0 · 5mmol NADP+，异丙醇为0 · 2~lOmmol，反应液总体积为 10mL。将反应置于20~35°C下，搅拌反应至结束。反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取三 次，合并萃取液，加入无水硫酸钠，干燥过夜，旋蒸获得(R)-CPMA。
[0096] 表7重组醇脱氢酶KpADH在不同反应条件下不对称还原CPMK的效果
[0097]
[0098] 实施例19重组醇脱氢酶KpADH催化CPMK的不对称还原反应
[0099] 于10ml磷酸钠缓冲液（lOOmmol · L-SpH 7.0)中加入实施例1所得的菌体10kU/L， 500mmo 1 · I/1的CPMK(溶解于异丙醇）500yL，在30°C，200rpm反应12h。反应过程示意图如图 4〇
[0100] 每隔一段时间取样 100yL，加入400yL PBS(100mmol · L-SpH 7.0)缓冲液和500yL 乙酸乙酯萃取，取出上层有机相，待有机相自然挥发完全，加入HPLC级的乙醇，进行正相 HPLC检测。具体条件如:Da i c e 1 Ch i r a 1 c e 1 0Β-Η (5μηι，2 50_ X 4 · 6mm)液相色谱柱，流动相 为正己烧：乙醇：乙醇胺（90:10:0.01，v/v/v)，流速lmL/min，柱温30°C，紫外检测波长 254nm，进样量10yL，保留时间：（R)-(4'_氯苯基)-(吡啶-2'-基)-甲醇8.6711^11，（3)-(4'-氯 苯基）_(吡啶-2'-基)-甲醇9.37min。结果如表7。反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取三 次，合并萃取液，加入无水硫酸钠，干燥过夜，旋蒸获得(R)-CPMA。
[0101] 表8重组醇脱氢酶KpADH催化CPMK不对称还原反应进程表
[0103]由表7可以看出，反应10小时，转化率达到99.8%，从开始反应到反应结束，产物ee 值都保持在82.3%。产物的光学纯度液相色谱图分析如图5。
【主权项】
1. 一株重组表达来源于克鲁维酵母化luyveromyces sp.CCTCCM2011385)的醇脱氨酶 编码基因 kpa化，其特征在于所述基因的核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示，或对SEQ ID No. 1 所示碱基序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加得到的编码具有该醇脱氨酶活性的 蛋白的碱基序列。2. -种如权利要求1所述基因编码的醇脱氨酶KpADH，其特征在于，所述蛋白质氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示，由SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多 个氨基酸而得到的具有醇脱氨酶活性的衍生蛋白质。3. -种重组表达载体，携带如权利要求1所述醇脱氨酶编码基因的质粒。4. 一种重组表达基因工程菌，其包括如权利要求3所述的重组表达载体。5. 权利要求2所述醇脱氨酶在不对称还原潜手性双芳基酬合成手性双芳基醇中的应 用，其特征在于所述的醇脱氨酶的添加形式为该酶的粗酶液或整细胞，所述缓冲液中包括 MDP%含量为0~0.5 mmol/l;所述的潜手性双芳基酬如式1或式2所示的化合物;所述缓冲 液为憐酸盐缓冲液，憐酸盐浓度为0.1 mol/L，抑值为6.0~8.0;所述不对称还原反应的溫 度为20~35°C ;所述的不对称还原反应的时间W反应完全为准。其中化为2 ' -C1，3 ' -C1 及4 ' -C1、； R2为2 ' -C1，3 ' -C1 及4 ' -C1、； R3为Η及4 ' -C1。
【文档编号】C12N15/53GK105936909SQ201610373805
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】倪晔, 许国超, 唐铭烩, 董晋军, 边雅倩
【申请人】江南大学