lncRNA分子ENST00000438553及其在鼻咽癌辅助诊断中的应用
【专利摘要】本发明公开了lncRNA分子ENST00000438553及其在鼻咽癌辅助诊断中的应用。ENST00000438553的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。TCONS_00003617在鼻咽癌组织中的表达量明显高于癌旁组织，其可作为鼻咽癌分子标志物或靶点，应用于鼻咽癌临床早期诊断、预后判断或靶向治疗，并有利于进一步阐明鼻咽癌的发生发展机理、信号通路等，极具应用前景和理论价值。
【专利说明】
IncRNA分子ENST00000438553及其在鼻咽癌辅助诊断中的 应用
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及一种IncRNA分子 ENST00000438553及其在鼻咽癌临床诊断、治疗、预后评估或科学研究中的应用。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方最常见的恶性肿瘤之一，在 华南地区，尤其广东省发病率最高，居世界首位，故又著称"广东癌"。NPC对放射敏感，首选 放疗，其预后因疾病分期不同而差异巨大。Ι、Π 期患者单纯放疗效果明显，十年疾病相关生 存率、无复发生存率、无远地转移生存率都较高。但NPC起病隐匿，早期症状缺乏特异性，约 75%的患者确诊时已属III、IV期。晚期NPC的疗效仍相当令人失望，易出现复发和远处转 移，5年生存率仅35%。因此，早发现、早治疗是提高鼻咽癌患者生存率的关键。鼻咽癌的发 生发展是一个多因素、多基因参与的动态过程，因此，探索其动态发展的分子机制，寻找鼻 咽癌相关分子标志物，以进一步明确其发病机制，并开发出可应用于临床早期诊断、治疗和 预后评估的试剂或产品，对提高鼻咽癌的诊疗水平、减低复发转移率具有重要意义。
[0003] 人类基因组中存在大量转录的长链非编码RNA(Long Noncoding RNA，IncRNA)，是 一类转录本长度超过200nt核苷酸单位的功能性RNA分子。研究发现，IncRNA参与了基因组 印记及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在致癌和抑癌 途径中亦显露出重要的调控作用，已成为继miRNA研究的新热点。LncRNA已显示参与了许多 肿瘤的发生和发展，然而，在鼻咽癌方面的研究仅见极少量的报道。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种IncRNA分子及其 在鼻咽癌辅助诊断中的应用。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供上述IncRNA分子在鼻咽癌治疗或预后评估中应用。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供上述IncRNA分子在制备鼻咽癌预防或治疗药物中 的应用。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
[0008] 一种在鼻咽癌组织中高表达的IncRNA分子，名称为ENST00000438553,其核苷酸序 列如SEQ ID N0.1所示。
[0009] IncRNA分子ENST00000438553在鼻咽癌辅助诊断或鼻咽癌治疗/预后评估中的应 用。
[0010] IncRNA分子ENST00000438553在制备鼻咽癌辅助诊断或鼻咽癌治疗/预后评估试 剂或试剂盒中的应用。
[0011] 用于检测IncRNA分子ENST00000438553的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断或鼻咽癌治 疗/预后评估试剂或试剂盒中的应用。
[0012] 所述用于检测权利要求1所述IncRNA分子的试剂包括用于扩增权利要求1所述 IncRNA分子的特异性引物对。
[0013] 所述用于扩增权利要求1所述IncRNA分子的特异性引物对，序列如下所示：
[0014] F:5'-CCACTTCCAGAGGGTAGCA-3'（SEQ ID N0.4);
[0015] R:5'-CCCCACTGCTGAGATGTTG-3'（SEQ ID N0.5)。
[0016] IncRNA分子ENST00000438553作为鼻咽癌治疗靶点的应用。
[0017] IncRNA分子ENST00000438553在制备预防或治疗鼻咽癌药物中的应用。
[0018] -种用于鼻咽癌辅助诊断或预后评估的试剂盒，其中包括：
[0019] (1)用于扩增IncRNA分子ENST00000438553的特异性引物对；
[0020] (2)标准 DNA 模板；
[0021] (3)PCR 反应液。
[0022] 一种检测IncRNA的方法，包括如下步骤：
[0023] (1)提取样品总RNA;
[0024] (2)制备样品(]dna;
[0025] (3)定量扩增 IncRNA;
[0026] 所述 IncRNA 为 ENST00000438553。
[0027]本发明的有益效果是：
[0028] 本发明成功筛选出鼻咽癌组织中高表达的IncRNA分子，其可作为鼻咽癌分子标志 物或靶点，应用于鼻咽癌临床早期诊断、预后判断或靶向治疗，并有利于进一步阐明鼻咽癌 的发生发展机理、信号通路等，极具应用前景和理论价值。
【附图说明】
[0029] 图1变性琼脂糖凝胶电泳检测鼻咽癌及癌旁组织总RNA;
[0030] 图2微阵列荧光扫描图；
[0031] 图3样品荧光强度分布图；
[0032]图4芯片杂交信号强度散点图；
[0033]图5层次聚类分析图；
[0034] 图6 qRT-PCR中lncRNA:ENST00000438553对应的溶解曲线与扩散曲线图；
[0035] 图7 qRT-PCR检测lncRNA:ENST00000438553表达升高倍数柱状图；
[0036]图8非癌组体检结果饼状图；
[0037] 图9非癌组患者体检异常概况柱状图；
[0038] 图10实验组和对照组的性别分类条形图；
[0039] 图11实验组和对照组的年龄分类条形图；
[0040] 图12外周血标本总RNA变性琼脂糖凝胶电泳图（其中41 -49为RNA连续性完整的电 泳结果图，16/24/25/27为RNA降解的电泳结果图）；
[0041 ] 图13 ENST00000438553的扩增和溶解曲线图（其中左图为扩增曲线图，右图为溶 解曲线图）；
[0042] 图14 ENST00000438553在实验组和非癌组的相对表达量散点图（P〈0.001);
[0043] 图15 ENST00000438553的表达量与鼻咽癌患者局部肿瘤大小分组的箱线图（P = 0.928)；
[0044] 图16 ENST00000438553的表达量与鼻咽癌患者淋巴结转移范围分组的箱线图（P = 0.529)；
[0045] 图17 ENST00000438553的表达量与NPC患者TNM总分期分组的箱线图（P = 0.657);
[0046] 图 18 ENST00000438553表达量的ROC曲线图。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采 用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳 等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》（第三版） (Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002,北京：科学出版 社），或按照制造厂商所建议的条件。
[0048] 实施例1
[0049] -、鼻咽癌相关IncRNA分子的筛选
[0050] 1、病例收集
[00511收集19例于2014年2月-2014年8月在广东省佛山市第一人民医院鼻咽放疗科就诊 住院的患者。所有患者术前未行放化疗，排除其他系统性病史，各重要器官功能在正常范 围，年龄21-61岁，中位年龄45岁，样本临床资料详见表1，随机选择其中6例用于芯片研究， 其余13例用于进一步验证。试验中标本采集均已取得病人知情同意，并从广东省佛山市第 一人民医院伦理委员会得到认可授权。
[0052]表1收集19例鼻咽癌病例的相关临床参数
[0054] 2、样本采集
[0055] 1)首先准备好用于保存组织的冻存管，且用黑色油性记号笔在冻存管上标明样本 分组、编号、收集日期等信息；
[0056] 2)门诊活检钳取鼻咽癌及癌旁组织(具有5年以上操作经验的鼻内镜技师操作）；
[0057] 3)将钳取的癌和癌旁组织标本均分成2份，其中1份送病理组织学鉴定，另1份放入 备好的冻存管中并拧紧，迅速投入液氮运输罐中冷却，待彻底冷冻后转移至-80°C冰箱保 存；
[0058] 4)填写标本登记单，写明样本编号、分组、来源患者名称、病案号、样本收集日期及 样本处理过程等情况；
[0059] 5)待病理性质确诊后取出标本开展下一步研究。
[0060] 3、总RNA样品制备、纯化及质检
[0061 ] (1 )TRIZ0L 法提取 RNA 样品；
[0062] (2)采用RNeasy柱对总RNA样品进行纯化；
[0063] (3)RNA定量和质量控制(采用Nanodrop ND 1000紫外可见分光光度计以及凝胶电 泳检查确定样品总RNA浓度和质量）。
[0064] Nanodrop分光光度计对鼻咽癌及癌旁组织总RNA测定结果如表2所示。鼻咽癌及配 对癌旁组织总RNA变性琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，图示18S rRNA和28S rRNA条带清晰， 两条带的亮度之比约为1:2,说明提取的组织总RNA完整性好，没有降解，无污染，纯度高，质 量可靠。
[0065] 表2 Nanodrop分光光度计对鼻咽癌及癌旁组织总RNA测定
[0066]
[0067] *对于分光光度计中，0. D. A260/A280比值应接近2.0为纯的RNA(1.8和2.1之间的 比率是可接受的）。在0.D.A260/A230比值应大于1.8。
[0068] 4、标记反应
[0069] 标记反应使用Quick Amp Labeling Kit,0ne_Color(Agilent p/n 5190-0442)试 剂盒，操作步骤参照试剂盒说明书进行。
[0070] 5、标记/扩增的RNA的纯化和标记cRNA的质量控制
[0071 ]使用RNeasy Mini Kit(Qiagen p/n 74104)对标记/扩增的RNA进行纯化。取 1 ·5μ1 纯化标记的cRNA用NanoDrop ND-1000定量。标记的cRNA特异性活性可用下式算得：
[0073] 如果量小于1.65yg且特异性活性小于9.0pmolCy3每ygcRNA，则不能进行杂交，再 次制备cRNA。
[0074] 6、芯片杂交
[0075] 1)在10X封闭试剂冻干瓶中加入500μ1无核酸酶的水，振荡混匀；
[0076] 2)水浴平衡在60°C，每个微阵列实验，将以下组分按下表所列顺序依次加入到 1.5ml无核酸酶的微量离心管中，在振荡混合器上充分而轻柔的混匀；
[0078] 3)在60 °C孵育整30分钟以片段化RNA;
[0079] 4)在美国Arraystar公司的全基因组微阵列芯片Human LncRNA Array ν3·0 (8x60K)上加入55ul 2x GEx杂交缓冲液HI-RPM以终止片段化反应；
[0080] 5)仔细吹吸以充分混合，注意不要造成气泡，勿在振荡混合器上混匀，在振荡混合 器上混合会造成气泡；
[0081] 6)室温下以13,000rpm离心1分钟使样品从壁上和盖子上离下来并帮助减少气泡， 将样品置冰上并尽快上样至芯片；
[0082] 7)将干净的密封垫片基标记朝上与杂交室基座的矩形截面对准装入安捷伦 SureHyb杂交室基座，确保密封垫片基与杂交室基座完全平齐不翘起。
[0083] 8)慢慢将100μΙ杂交样品以一种"边拖边装"的方式分配到密封孔中，将芯片慢慢 放在SureHyb密封垫片基上，这样"Agilent"标记条码朝下而数字条码朝上，确认这种三明 治排列；
[0084] 9)将SureHyb杂交室盖在三明治结构的片基上并滑动夹子将两片组装起来，将夹 子手工紧固到杂交室上；
[0085] 10)垂直旋转装好的杂交室到密封圈上，估计气泡的活动性，将装好的片基杂交室 放入杂交炉烤室内，设定至65°C，设定杂交旋转器至10rpm，65°C杂交17小时。
[0086] 7、用Gene Expression Wash Buffer洗涤芯片
[0087] 8、扫描并提取数据
[0088] 1)扫描操作步骤：
[0089]①将芯片装在芯片托上；
[0090] ②将装好的芯片托放入到扫描仪传送带上；
[0091] ③确认单色扫描的扫描设定：
[0093]④点击扫描控制主窗体上的Scan Slot m-n，字母m表示第一个芯片所在的开始的 槽，而字母η表示最后一个芯片所在的结束槽。
[0094]图2为微阵列焚光扫描图。其中，lcancer_6cancer号为鼻咽癌组织焚光扫描图， lpracancer-6pracancer号为鼻咽癌癌旁组织扫描图。所有焚光扫描图杂交点均勾、无污 染、杂交信号强度大，说明实验结果符合要求。
[0095]图3为样品荧光强度分布图盒形图示一种简便方法快速直观地显示数据集的分 布。它通常用于比较的从所有样品的强度分布。X轴为每块微阵列编号，Y轴为归一化处理后 的荧光强度。每块微阵列荧光强度基本相同，说明实验结果符合要求。
[0096] 图4为芯片杂交信号强度散点图。散点图两个比较的样品或样品的相比较的两个 组之间是一种用于评估LncRNA基因的表达变化的可视化方法。散点图中的X轴和Y轴的值是 样品的归一化的信号值。绿色线倍数改变线(默认的倍数变化2.0)。上述LncRNAs对角线上 面的绿线和下面绿线之间以外区域表示超过2.0倍数变化的LncRNAs。
[0097] 图5为层次聚类分析图。层次聚类是最广泛使用的聚类方法分析IncRNA表达数据 之一。聚类分析将样品排列成组基于他们的表达水平，从而使我们能够推测样品之间的关 系。样本之间长链非编码基因表达谱的差异。说明大部分信号在鼻咽癌组织中表达异常。 [0098] 最终，芯片共筛选差异表达IncRNA 6320条，挑选其中3条表达上调的进行qRT-PCR 验证。表3中569的1116、6611635〇]113〇1、？〇1(1(31^1^6分别代表序列名、基因记号、倍数变化。其 中，ENST00000438553的核酸序列如SEQ ID N0.1所示，其在鼻咽癌组织中的表达量明显高 于癌旁组织，极有可能成为分子标志物或靶点，在鼻咽癌临床早期诊断、预后判断或靶向治 疗等方向上具有广阔的应用前景。
[0099] 表3差异表达LncRNA上调的倍数
[0101] 9、筛选表达差异倍数较大的IncRNA进行qRT-PCR验证 [0102] (1)引物设计
[0103]依据实时定量荧光PCR引物设计原则，使用Primer5.0软件设计实时定量荧光PCR 引物。其中LncRNA实时定量荧光PCR引物上游是特异性的，下游是随机通用引物，LncRNA实 时定量PCR荧光引物上下游都是特异性的，需要用软件进行设计。本研究使用的引物全部由 上海康成生物技术有限公司合成，其中GAPDH为内参校准基因。
[0104]引物详细序列见表4:
[0105] 表4实时定量荧光PCR引物
[0106]
[0107] (2)合成 cDNA
[0108] (3)qRT_PCR 检测
[0109] ①制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板
[0110] 针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行 PCR(反应体系如表5)反应:轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置PCR反应:95 °C， 1〇11^11;40个?0?循环(95°(：，10秒;60°(：，60秒(收集荧光））。
[0111] 表5 PCR反应体系
[0113] PCR产物与100bp DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物 是否为单一特异性扩增条带。
[0114] 将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1 X ΠΓ1，1 X 10 ―2,1 X 10-3,1 X 10-4,1 X 10-5,1 X 10-6,1 X 10-7,1 X 10-8,1 X 10-9,这几个梯度浓度的 DNAo
[0115] ② qRT-PCR 反应
[0116] 将所有cDNA样品分别配置Real time PCR反应体系。体系配置如表6，并轻弹管底将 溶液混合，5000rpm短暂离心。加样：
[0117] a.将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中；
[0118] b.再加入对应的2μ1 cDNA;
[0119] c.小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合；
[0120] d.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
[0121]表6 Realtime PCR反应体系
[0123] 将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应，所有的指标均按以下程序 进行:95°C，10min;40个PCR循环(95°C，10秒;60°C，60秒(收集荧光））。
[0124] 为建立PCR产物熔解曲线，扩增反应结束后，按(95 °C，10秒;60 °C，60秒;95 °C，15 秒）；并从60 °C缓慢加热到99 °C (仪器自动进行-Ramp Rate为0.05 °C /秒）。
[0125] (4)qRT_PCR 结果与计算
[0126] 各样品的目的基因和管家基因分别进行qRT-PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标 准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓 度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。统计软件SPSS 17.0进 行数据分析。用2-MCT表示各样本的IncRNA的相对表达变化倍数。数据符合正态分布时釆 用两组独立样本的t检验，不符合正态分布时用两组独立样本的秩和检验，P〈0.05时具有统 计学意义。
[0127] qRT-PCR结果如图6和图7所示。从图6中可见整个实验过程反应过程良好，无非特 异性扩增产物，qRT-PCR结果可靠。与癌旁组织相比，ENST00000438553在鼻咽癌组织中均上 调(P〈0.05)。结果表明，qRT-PCR结果与芯片检测结果一致。
[0128] Real-time PCR验证的差异表达IncRNA柱状图，可以看到：以GAPDH的表达量作为 参照，癌组织中的ENST00000438553与癌旁组相比，表达上调，与芯片结果一致。
[0129] 实施例2
[0130] 为了进一步验证lncRNA:ENST00000438553可作为鼻咽癌分子标志物或靶点，发明 人进一步扩大了取样数量，进行进一步的实验。
[0131] 1、病例收集
[0132] 收集2012年12月-2015年8月于佛山市第一人民医院头颈放疗科住院的鼻咽癌患 者的外周血标本为实验组标本库，而对照组的非癌外周血标本库分别取自于2015年9月- 2015年11月于佛山市第一人民医院保健科体检和耳鼻咽喉科住院患者，试验中标本采集取 得患者知情同意并从广东省佛山市第一人民医院伦理委员会得到认可授权。鼻咽癌患者治 疗前均完善全身体格检查、头颈部核磁共振检查(magnetic resonance imaging，MRI)、全 身骨显像(whole body bone scanning)、腹部超声和胸部X光片。
[0133]表7鼻咽癌患者临床资料概况
[0135] 但是，在对102例的鼻咽癌患者临床资料分析中，发现8(7.8%)例患者经确诊或辅 助化疗后放弃治疗或拒绝随访，2(2.0 % )例患者有遗传病病史，9(8.8% )例患者有乙肝病 毒感染病史，14(13.7% )近期感染病史，18( 17.6% )例患者有高血压或糖尿病或冠心病病 史。根据实验组鼻咽癌患者的入组标准:年龄18-70岁，鼻咽组织病理确诊为鼻咽癌，入组前 未行手术或放化疗，排除其他系统现病史，各重要器官功能在正常范围，KPS评分 (Karnof sky score，KPS)彡80，最后有58(56.9% )符合入组标准，排除其他系统疾病影响。 因此，选取符合入组标准的58例鼻咽癌患者进行后续实验分析。
[0136] 入组的58例鼻咽癌患者均进行了放疗，其中进行调强根治性放疗的患者有55 (94.8 % )例，有3 (5.1 % )例患者进行了高姑息性放疗，鼻咽癌患者放疗的体位要求和靶区 勾画遵照放疗的规范化操作。调强照射剂量：原发灶(GTVnx)68-72Gy，颈部受累淋巴结区 (GTVnx)68-70Gy，临床靶体积1 (CTV-1 )60Gy，临床靶体积2(CTV-2)54Gy，总剂量分30次进 行，每天1次，每周5天。同时，鼻咽癌患者还接受化学治疗，同期化疗方案主要采用顺铂单 药，诱导或辅助化疗主要采用PF(顺铂+5-氟脲嘧啶)或TPF(多西他赛+顺铂+5-氟脲嘧啶)联 合化疗方案。入组的58例鼻咽癌患者有3(5.2%)例进行了姑息性放化疗，4(6.9%)例进行 了诱导或辅助化疗+放疗，7(12.1%)例仅进行了同期放化疗，44(75.9%)例进行了辅助化 疗+同步放化疗。
[0137] 在非癌患者外周血标本库中，总共有78例患者标本入库，其中，男性41例，女性37 例，年龄范围为20-68岁，中位年龄为41岁。（其临床资料详见表8)。
[0138] 表8非癌组患者临床资料
[0140] 在78例非癌患者中，2(2.6 % )例体检发现地中海贫血，3 (3.8 % )例体检确诊冠心 病，4(5.1%)例体检肿瘤指标异常，8(10.3%)例体检发现血耐量异常或确诊糖尿病，9 (11.5 % )例体检确诊为高血压病，11 (14.1 % )例体检确诊乙肝病毒携带，18(23.1 % )例抽 血前1周内有感染病史，根据入组标准:排除任何肿瘤疾病史，年龄18-70岁，各重要器官功 能均在正常范围，排除其他系统现病史，最后有29(37.2%)例患者体检无明显异常符合入 组标准，进行后续试验（图8，图9)。
[0141] 利用卡方检验分析实验组58例与对照组29例符合入组标准患者的性别和年龄分 组的差异，差异无统计学意义(图10,图11)。
[0142] 2、样本采集
[0143]所有外周血标本均在患者空腹状态下抽取得，量约2ml，存于含EDTA抗凝剂的无菌 试管中，管上表明样本编号，并放置4°C冰箱预存，尽量在血液离体后2小时内进行试验。试 验中标本采集取得患者知情同意并从广东省佛山市第一人民医院伦理委员会得到认可授 权。
[0144] 3、总RNA样品制备、纯化及质检
[0145] 1 )TRIZ0L 法提取 RNA 样品；
[0146] 2)采用RNeasy柱对总RNA样品进行纯化；
[0147] 3)RNA定量和质量控制（采用Nanodrop ND 1000紫外可见分光光度计以及凝胶电 泳检查确定样品总RNA浓度和质量）。
[0148] Nanodrop分光光度计对鼻咽癌组与非癌组的87例样本总RNA测定结果如表3所示。 总RNA变性琼脂糖凝胶电泳中，28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓，上面一条带的密度大 约是下面一条带的2倍，说明总RNA的质量和纯度较好。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将 会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迀移物质或者带。RNA的降解表现为 核糖体RNA带的弥散。从29例对照组和58例鼻咽癌实验组外周血标本的变性琼脂糖凝胶电 泳检测实验结果来看，部分样本存在RNA降解严重的问题（图12)。为了不影响后续实验结 果，本课题组从中挑选了其中17例非癌患者和51例鼻咽癌患者外周血标本的总RNA进行后 续实验。
[0149] 表9分光光度计检测87例样本提取的总RNA
[0154] *对于分光光度计中，0. D. A260/A280比值应接近2.0为纯的RNA(1.8和2.1之间的 比率是可接受的）。在0.D.A260/A230比值应大于1.8。
[0155] 4、qRT_PCR
[0156] 1)引物设计
[0157] 表10 qRT-PCR引物序列及特征
[0158]
[0159] 2)其余步骤与第一部分鼻咽癌相关IncRNA分子的筛选中所使用的qRT-PCR-致。
[0160] 3) qRT-PCR 结果
[0161] qRT-PCR结果以管家基因 β-actin作为内参，将ENST00000438553基因在鼻咽癌患 者外周血标本进行qRT-PCR验证，以非癌患者外周血标本为对照，由实验得到的溶解及扩增 曲线图（图13)，从图中可见实验过程中无特异性扩增产物，实验结果可靠。
[0162] 使用Mann-Whitney U检验，发现与非癌患者相比，ENST00000438553在鼻咽癌外周 血中显著下调（图14，P〈0.001)。
[0163] 5、临床数据的分析统计
[0164] 根据标准曲线及各样本的Ct值，可得到管家基因和ENST00000438553在各样本中 的拷贝数，即可得到ENST00000438553在各组样本中经管家基因 β-actin校正的相对表达 量，统计分析可得ENST00000438553在鼻咽癌患者外周血标本的中位相对表达量为 0.00245,在非癌外周血标本的中位相对表达量为0.00730。根据NPC患者临床特点，把局部 肿瘤大小(Ti+h期、T 3期和T4期）、淋巴结转移范围(No、Ν!、N2和N3组）、TNM总分期（I期+ Π 期、 ΙΠ 期和IV期）分组，把ENST00000438553的表达量作为连续变量，进行Kruskal-Wallis检验 分析，发现ENST00000438553的表达与上述临床特征分组并无明显的差异意义（图15，图16， 图 17)。
[0165] 进一步将对照组非癌患者外周血中ENST00000438553的表达量分别与NPC患者的T 分组中的Tl+T2组、N分组的Nq+Ni组和T匪总分期的〗+ Π 期分组的表达量进行两组间的Mann-Whitney U检验分析，则发现ENST00000438553在早期NPC患者的表达较非癌患者中表达具 有显著的统计学差异(表11)。
[0166] 表11非癌组与!^!^组、Νο+Ν!分组、1+ Π 期分组的ENST00000438553表达差异
[0167]
[0168] 为了更加直接地显示该基因在NPC患者与非癌患者标本的差异性是否对NPC的早 期诊断有一定意义，而R0C曲线可应用于诊断效能的评价，因此利用R0C曲线法进一步分析 (图 18)。
[0169] R0C曲线分析可通过临界点的变化，获得多对灵敏度和特异度，并以灵敏度为纵 轴，1-特异度为横轴，连接各临界点绘制成曲线。曲线下面积(area under the curve，AUC) 一般在1.0和0.5之间，如AUC小于0.5，则不符合真实情况，AUC越接近1，诊断效能越佳。本研 究中根据R0C曲线可得曲线下面积为0.810M). 5,诊断效能较好，可见检测外周血中 ENST00000438553的表达量作为NPC的诊断手段具有一定的准确性。从曲线的分析中，可得 ENST00000438553敏感度和特异度皆最优的截断点（cutoff point)为2·35X 10-4,其灵敏度 (sensitivity)为90.2%，特异度(specific)为70.6%。基于此值，将所有临床数据，包括年 龄、性别、局部肿瘤大小、远处转移与否、淋巴结转移范围、?Μ总分期、EBV-DNA表达量，分成 低表达量组（<2.35 X 10-4)和高表达量组(>2.35 X 10-4)进行卡方检验分析和关联分析，结 果显示ENST00000438553的表达与患者的性别、年龄、淋巴转移、远处转移分组无统计学差 异，关联性较小(表12)。
[0170] 表12 ENST00000438553的表达量与NPC患者临床资料卡方分析和关联分析
[0171]
[0172] 但ENST00000438553在NPC的T分中的Τ!期和T2期患者中较非癌患者表达下调明显， 在NPC的ΤΝΜ分期的Ι、Π 期也较非癌对照组表达下调显著，表明ENST00000438553在NPC与正 常人的甄别中有一定的统计学意义(表13)。
[0173] 表13非癌外周血组与NPC外周血组的ENST00000438553表达量卡方检验
[0174]
[0175] 以上结果表明，lncRNA:ENST00000438553在鼻咽癌组织中的表达量明显高于癌旁 组织，但在外周血中鼻咽癌患者的表达显著低于非癌患者。极有可能成为分子标志物或靶 点，在鼻咽癌临床早期诊断、预后判断或靶向治疗等方向上具有广阔的应用前景。
【主权项】
1. 一种在鼻咽癌组织中高表达的IncRNA分子，名称为ENST00000438553，其核苷酸序列 如SEQ ID N0.1 所示。2. 权利要求1所述的IncRNA分子在鼻咽癌辅助诊断或鼻咽癌治疗/预后评估中的应用。3. 权利要求1所述的IncRNA分子在制备鼻咽癌辅助诊断或鼻咽癌治疗/预后评估试剂 或试剂盒中的应用。4. 用于检测权利要求1所述IncRNA分子的试剂在制备鼻咽癌辅助诊断或鼻咽癌治疗/ 预后评估试剂或试剂盒中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于检测权利要求1所述IncRNA分子 的试剂包括用于扩增权利要求1所述IncRNA分子的特异性引物对。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述用于扩增权利要求1所述IncRNA分子 的特异性引物对，序列如下所示： F:5'-CCACTTCCAGAGGGTAGCA-3'（SEQ ID N0.4); R:5'-CCCCACTGCTGAGATGTTG-3'（SEQ ID N0.5)。7. 权利要求1所述的IncRNA分子作为鼻咽癌治疗靶点的应用。8. 权利要求1所述的IncRNA分子在制备预防或治疗鼻咽癌药物中的应用。9. 一种用于鼻咽癌辅助诊断或预后评估的试剂盒，其中包括： (1) 用于扩增权利要求1所述IncRNA分子的特异性引物对； (2) 标准DNA模板； (3) PCR反应液。10. -种检测IncRNA的方法，包括如下步骤： (1) 提取样品总RNA; (2) 制备样品。0熟； (3) 定量扩增IncRNA; 所述IncRNA如权利要求1所述。
【文档编号】C12Q1/68GK105936904SQ201610389927
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】王跃建, 罗微, 夏世同, 唐隽, 陈伟雄
【申请人】佛山市第人民医院, 佛山市第一人民医院