专利名称：一种与ebv感染相关的鼻咽癌诊断和治疗的分子靶标及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子靶标技术领域，涉及EBV感染相关的鼻咽癌诊断与治疗的分子靶标及其应用。
背景技术：
根据国际癌症研究署对致癌因子的分类标准，EB病毒被列在第一组致癌因子中。 EBV与中国南方高发的鼻咽癌(NPC)密切相关。在NPC组织中，几乎所有低分化肿瘤细胞中含有EBV基因组。EBV基因组的存在对相关肿瘤的发生发展具有重要作用。有学者认为肿瘤组织的环境如其中的病毒会引起瘤细胞miRNA的表达谱异常的改变，可以用来解释某些病毒与肿瘤高度相关的重要原因。关于EBV、miRNA与相关肿瘤的关系是否是这样，尚没有研究报道确证，由EBV直接影响的miRNA至今知之甚少。Hsa-miR203在NPC中的作用及其是否与EBV的作用相关及机制均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与EBV感染相关的鼻咽癌诊断与治疗的分子标志物及其应用，一种与EBV感染相关的鼻咽癌诊断和治疗的分子靶标Hsa-miR203，序列为
gUgBBBUgUUUBggBCCBCUBgo所述的分子靶标Hsa-miR203应用于制备与EBV感染相关的鼻咽癌诊断的试剂。所述的分子靶标Hsa-miR203应用于制备与EBV感染相关的鼻咽癌诊断的试剂盒。所述的分子靶标Hsa-miR203应用于制备与EBV感染相关的鼻咽癌治疗的试剂。本发明的研究过程如下(1)与293空白差异miRNA芯片筛选结果中选取下调明显的hsa-miR203 ;(2)分别提取四3，四3_空白，293-EBV，Lm(Lm细胞系是 293-EBV细胞系通过低密度培养，EBV丢失后细胞的混合克隆)；永生化人鼻咽上皮细胞 NP69细胞系，NP69-空白对照细胞系，EBV癌基因LMPl稳定转染的NP69-LMP1细胞系；鼻咽癌HONEl细胞，HONEl-空白对照细胞系，HONEl (EBV+)细胞系；鼻咽癌HNE2细胞系，HNE2-空白对照细胞系，HNE2 (EBV+)细胞系；鼻咽癌；5-8F空白对照细胞系；5_8F(EBV+)细胞系； 四例正常人EBV(-)淋巴细胞，四株EBV稳定感染的淋巴细胞系(LCL)，Raji (EBV+)细胞， B95-8 (EBV+)的Total RNA ； (3)分别提取11例正常鼻咽上皮组织与31例低分化鼻咽癌组织的Total RNA ； (4)用hsa-miR203特异性逆转录试剂盒将总RNA逆转为cDNA ； (5)用 hsa-miR203stem-loop 引物进行 Real-Time PCR 扩增；(6)对 hsa_miR203 的生物功能研究及其靶基因验证。通过对EBV稳定感染的人胚肾上皮细胞293-EBV及其对照进行microRNA芯片筛查发现hsa-miR203在^3_EBV中表达明显下调。Real-timePCR验证了 hsa_miR203在四3，四3_空白，293-EBV，Lm(Lm细胞系是^3_EBV细胞系通过低密度培养，EBV丢失后细胞的混合克隆)细胞系中的表达情况[图1]结果显示hsa-miR203在293-EBV细胞系中表达下降5. 1倍(ρ < 0. 01)，在EBV丢失的细胞系Lm中hsa_miR203表达几乎恢复EBV感染前表达水平(ρ <0.01) ；Real-time PCR验证了 hsa_miR203在四例正常人EBV (-)淋巴细胞(Lym EBV-)，四株EBV稳定感染后永生化的淋巴细胞系(EBV+) (E18，E14，E33，E20)， Raji (EBV+)细胞，B95-8 (EBV+)细胞中的表达情况[图2A]结果显示EBV稳定感染的淋巴细胞系hsa-miR203表达较^V阴性的淋巴细胞明显降低(ρ < 0. 01)。Real-time PCR 方法检测hsa-miR203与LMPl在正常人淋巴细胞(Lym) EBV (-)，四株EBV稳定感染的淋巴细胞系[E33，E20, E18，E14]，(EBV+)，B95-8 (EBV+)细胞中的表达情况[图2B]结果显示hsa-miR203表达量与LMPl的表达量呈负相关性(R = -0. 99) ；Real_timeqPCR检测永生化人鼻咽上皮细胞NP69细胞系，NP69-空白对照细胞系，EBV癌基因LMPl稳定转染的 NP69-LMP1细胞系；鼻咽癌HONEl细胞，HONEl-空白对照细胞系，HONEl (EBV+)细胞系；鼻咽癌HNE2细胞系，HNE2-空白对照细胞系，HNE2 (EBV+)细胞系；鼻咽癌5-8F细胞，5-8F空白对照细胞系；5-8F(EBV+)细胞系中hsa-miR203表达情况[图3A]，结果表明LMPl，EBV 能明显下调hsa-miR203的表达(ρ < 0. 01)。Real-time qPCR检测EBV阳性低分化鼻咽癌组织中hsa-miR203表达情况[图结果表明低分化鼻咽癌组织(低分化鼻咽癌中几乎百分之百EBV阳性)中hsa-miR203表达较正常对照平均下调4. 9倍(ρ < 0. 01)。随后对hsa-miR203的生物学功能进行研究结果表明hsa-miR203通过其调控的靶基因E2F3， CCNGl等明显抑制细胞的增殖和转化能力[图4，5，6]。综上hsa-miR203可以作为与EBV 感染相关的鼻咽癌诊断与治疗的分子靶标。本发明提供了一种与EBV感染相关的鼻咽癌诊断和治疗的分子靶标hsa-miR203 及其应用。该microRNA能准确反映EBV病毒在细胞及组织内保留与丢失的情况；进而能够用于EBV感染相关的鼻咽癌诊断，同时还发现hsa-miR203通过其调控的靶基因E2F3， CCNGl等明显抑制细胞的增殖和转化能力，可以用于治疗EBV感染相关的鼻咽癌。所以 hsa-miR203具有重要的科研理论和临床应用价值。为EBV相关肿瘤的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据。
图 1 :real-time PCR 方法检测 hsa_miR203 在四3，四3_ 空白，293-EBV，Lm，细胞中的表达结果图；可见hsa-miR203在^3-EBV中表达下调5. 1倍，在EBV丢失的Lm细胞中明显恢
复表达；图2A :real-time PCR方法检测hsa_miR203在正常人淋巴细胞(Lym) ^V (-)，四株EBV稳定感染的B淋巴细胞系[E33，E20, E18，E14]，Raji (EBV+)，B95-8 (EBV+)细胞中的表达结果图；图2B :real-time PCR方法检测hsa_miR203与LMPl在正常人淋巴细胞(Lym) EBV (-)，四株 EBV 稳定感染的 B 淋巴细胞系[E33，E20，E18，E14]，(EBV+)，B95-8 (EBV+)细胞中的表达结果图；可见hsa-miR203表达量与LMPl的表达量呈负相关性；图3A :real-time PCR方法检测hsa_miR203在永生化人鼻咽上皮细胞NP69细胞系，NP69-空白对照细胞系，EBV癌基因LMPl稳定转染的NP69-LMP1细胞系；鼻咽癌HONEl 细胞，HONEl-空白对照细胞系，HONEl (EBV+)细胞系；鼻咽癌HNE2细胞系，HNE2-空白对照细胞系，HNE2 (EBV+)细胞系；鼻咽癌；5-8F空白对照细胞系；5_8F(EBV+)细胞系中的表达结果图；可见，EBV感染的细胞系hsa_miR203表达明显下调(ρ < 0. 01)；图;3B :real-time PCR方法检测hsa-miR203在正常鼻咽上皮与低分化鼻咽癌组织中的表达结果图；可见，在低分化鼻咽癌组织(EBV+)中hsa-miR203表达明显下调(ρ < 0. 01)；图4 荧光素酶活性检测结果显示图；可见，E2F3，CCNGl，RAP1A，野生型荧光报告质粒共转染hsa-miR203后较对照组和突变组，其荧光素酶活性能明显下降(P < 0.01)；图5 流式细胞仪周期检测结果图；可见，转染hsa-miR20;3mimics细胞Gl期百分率增加(ρ < 0. 05)，S期百分率减少 (P < 0. 05)，抑制细胞从静止期向增殖期转化；图6 裸鼠瘤实验结果图；可见，不同处理组荷瘤裸鼠肿瘤及肿瘤生长曲线无酶水(DEPC)处理组； hsa-miR-203mimics处理组；结果显示has-miR-203能明显抑制肿瘤的增长(P < 0. 01)。
具体实施例方式以下结合具体实施方式
旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。(1)对前期构建的EBV稳定表达的293-EBV的细胞系及其对照组进行microRNA 芯片筛查，确定目标hsa-miR203 ；序列见序列表中的序列1，该序列可见miRBase the microRNA database ；http://www. mirbase. org/。(2)EBV稳定感染的293-EBV细胞(即HEK293稳定转染EBV病毒基因组细胞)， 四3_空白对照细胞系，293细胞系(即HEK293 人胚肾上皮细胞)，Lm细胞系Q93-EBV细胞系低密度培养时EBV丢失的细胞克隆)与10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。EBV永生化的淋巴母细胞四株[E33，E20，E18，E14]，Raji细胞(EBV阳性淋巴瘤细胞)，B95-8细胞(EBV 阳性绒猴淋巴细胞)，HONEl细胞(鼻咽癌细胞)，HONEl-空白对照细胞系，HONEl (EBV+)细胞系(稳定转染EBV病毒基因组的鼻咽癌细胞)；HNE2细胞系(鼻咽癌细胞)，HNE2-空白对照细胞系，HNE2(EBV+)细胞系(稳定转染EBV病毒基因组的鼻咽癌细胞)，5-8F细胞系(鼻咽癌细胞)，5-8F空白对照细胞系，5-8F(EBV+)细胞系(稳定转染EBV病毒基因组的鼻咽癌细胞)培养于10%胎牛血清的1640培养基中；NP69细胞系(永生化人鼻咽上皮细胞)， NP69-空白对照细胞系，NP69-LMP1细胞(EBV癌基因LMPl稳定转染的细胞)培养于无血清专门培养基。待细胞长满，除去培养基，收集上述细胞分别加Trizol Iml吹打混勻，冰上静置5-10min，提取RNA或_70°C保存。上述细胞系的建立及方法详见=Epstein-Barr virus infection facilitates the malignant potential of immortalized human epithelial cells :from latent genome to viral production and maintenance[J]. Lab Invest, 2010,90(2) :196-209. (IF = 4. 58)(3)无菌条件下取10例正常人(最终选取淋巴细胞EBV (_)四例做后续研究筛选
5方法见(8))静脉血anl，去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇勻，加入aiil Hanks溶液进行对倍稀释，混勻。用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中(血液=Hanks液淋巴细胞分离液的比例为1 1 1)，沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。经水平式离心2000r/minX20min，小心取出试管.用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次离心1500r/minX IOmin0弃上清，分别加Trizol Iml吹打混勻，冰上静置5-lOmin，提取RNA 或-70°C保存。(4)Trizol提取细胞总RNA 加氯仿200μ Ι/mlTrizol于Tube中，用手震荡 15-30s，冰上放置5min，4°C 12000g离心15min ；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0. 5ml/mlTrizol混勻，_20°C冰箱静置20min，4°C 12000g离心IOmin ；弃上清，加入 75% DEPC水稀释的乙醇l-2ml混勻，4°C 7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5_10min， 加入DEPC水10-20 μ 1溶解RNA。用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度_70°C保存。(5)收集11例正常对照鼻咽组织及31例低分化NPC组织，液氮保存。用Trizol 试剂盒提取NPC及正常对照鼻咽总RNA。把液氮冻存的组织经过显微切割技术获取较纯低分化NPC组织，加入适量的Trizol试剂(Trizol试剂加入量为lml/100mg组织)，裂解组织，冰上放置5min。吸入1.5ml离心管中，加入氯仿(氯仿加入量为0. aiil/ml Trizol)，冰上放置5min。IOOOOXg离心15min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置lOmin。10000 X g离心15min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理的双蒸水溶解。用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度-70°C保存。(6)用 DNase-I 消化 RNA 中痕量的 DNA 反应体积 100 μ 1，总 RNA 10 μ g、DNase-I 10u、RNasin 200u、Tris. Cl (pH 8. 3) 10mM、MgC12 10mM，37°C，lh，等体积苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，RNA溶于DEPC处理的水中。(7)用 DNase-I 消化 RNA 中痕量的 DNA 反应体积 100 μ 1，总 RNA 10 μ g、DNase-I 10u、RNasin 200u、Tris. Cl (pH 8. 3) 10mM、MgC12 10mM，37°C，lh，等体积苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，RNA溶于DEPC处理的水中。(8)从10例正常人淋巴细胞的Total RNA进行逆转录，使用RNA逆转录试剂盒(购于!^ermentas公司)，20 μ L逆转录反应的体系如下
权利要求
1.一种与EBV感染相关的鼻咽癌诊断和治疗的分子靶标Hsa-miR203，序列为 gugaaauguuuaggaccacuago
2.权利要求1所述的分子靶标Hsa-miR203应用于制备与EBV感染相关的鼻咽癌诊断的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述的分子靶标Hsa-miR203应用于制备与EBV感染相关的鼻咽癌诊断的试剂盒。
4.权利要求1所述的分子靶标Hsa-miR203应用于制备与EBV感染相关的鼻咽癌治疗的试剂。
全文摘要
本发明首次公开了一种与EBV感染相关的鼻咽癌诊断和治疗的分子靶标hsa-miR203及其应用。该microRNA能准确反映EBV病毒在细胞及组织内保留与丢失的情况；进而能够用于EBV感染相关的鼻咽癌诊断，同时还发现hsa-miR203通过其调控的靶基因E2F3，CCNG1等明显抑制细胞的增殖和转化能力，可以用于治疗EBV感染相关的鼻咽癌。所以hsa-miR203具有重要的科研理论和临床应用价值。为EBV相关肿瘤的诊断、治疗或预后判断提供新的线索和依据。
文档编号C12N15/113GK102174516SQ20111002320
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者俞海波, 卢建红, 唐海林, 喻正源, 李夏雨, 李小玲, 李桂源, 赵莲 申请人:中南大学