专利名称：人鼻咽组织特异性基因c10rf102编码蛋白的制备及其多抗、单抗的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及人鼻咽组织特异性基因C10RF102表达产物的获取及 抗体制备， 背景技术鼻咽癌是中国南方与东南亚地区常见的恶性肿瘤之一，该地区发病率居世界首位，严 重威胁人民的生命安全。目前鼻咽癌的早期检测方法有多种，包括EB病毒血清学标记物、 鼻咽癌相关肿瘤标记物如白细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子以及端粒酶等的检 测。虽然这些指标的单独或联合应用为鼻咽癌的诊断提供了有用的信息，但它们均缺乏足 够的灵敏度和特异性。比如EB病毒不但与鼻咽癌的发生有关，而且与Burkitt淋巴瘤、 上呼吸道的感染等密切相关，近来也有报导在各种T细胞淋巴瘤中检测到EB病毒DNA，而 且并非所有鼻咽癌的发生均与EB病毒相关，90%以上的人群在成年前都感染过EBV，在 NPC患者血清中检测到EBV也并不能证明EBV直接与NPC有关，鼻咽癌患者EB病毒抗体与 病理诊断相比阳性符合率仅为72.6% 77.3%。因此，虽然EB病毒相关抗体滴度与鼻咽癌 的发生发展有很高的相关性，其检测方法也有优越性，但仍然只能作为一种相关指标而起 提示作用，不能用来作为鼻咽癌的确诊指标。而其他的一些鼻咽癌相关的肿瘤标记物如白 细胞介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子以及端粒酶等，广泛表达于多种组织并且在不 同肿瘤中都存在一定的表达差异，因此应用与鼻咽癌诊断也缺乏特异性。克隆与鼻咽癌发 病密切相关的抑瘤基因是揭示鼻咽癌发病分子机制的必然途径，而且分子诊断灵敏度高， 特异性强，取材一般不受组织或时相限制，因此将成为鼻咽癌早期诊断的新型手段，也将 对鼻咽癌的防治产生重要的指导意义。我们发现的C10RF102基因是一个人鼻咽-气管上皮 组织特异性基因，在其他组织中没有表达，且在鼻咽癌中表达明显下调，因此，C10RF102 蛋白是一个鼻咽癌特异性的肿瘤标记物，检测C10RF102蛋白用于鼻咽癌的诊断具有准确 性和特异性高的优势。组织特异性基因是重要的功能基因，是特定组织维持其正常结构和 功能不可缺少的基因；另外，组织特异性基因在相应组织病理生理过程中往往扮演极其关 键的角色，并且被认为是组织特异性的诊断和药物治疗靶点。发明内容本发明的目的在于提供一种人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白的制备方法及 其单抗和多抗的制备方法。本发明的目的是通过以下方式实现的。人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白的制备方法的具体步骤为 根据C10RF102基因参考序列设计特异性引物，C10RF102-forward:5， -ATACATATGTCG GTGCGCACGTTACCG _3， ， C10RF102-reverse: 5' -CTCGAGCTATAACTCATCCATCAT - 3'，以 人胎脑cDNA文库质粒为模板，PCR扩增出C10RF102基因编码区；用Nde I和Xho I酶切 PCR扩增出的C10RF102基因编码区和pET28b载体，再将回收的5. 3kb长的pET28b载体片 段和C10RF102基因编码区连接，构建成含融合基因的pET28b-C10RF102载体，将含融合 基因的pET28b-C10RF102载体转入大肠杆菌RosettaBlue(DE3)中，经抗生素筛选、诱导表 达、破碎分离纯化即得人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白。所述的引物序列5'端带NdeI酶切位点，3'端引物带XhoI酶切位点。所述的抗生素筛选过程为将所述的pET28b-C10RF102重组质粒转化的大肠杆菌，接 种于含有200 ug/ml卡那霉素的细菌培养皿上，37'C培养14-20小时，沾取单个菌落接种 入3ml含有200 ug/ml卡那霉素、34吗/ml氯霉素和12. 5pg/ml四环素的LB培养液中，37°C 过夜培养；将lml过夜培养物接种至100ml含有200 ug/ml卡那霉素、34pg/ml氯霉素和 12. 5ng/ml四环素的LB培养液中，于37。C培养3小时至OD柳为0. 6，得OD咖为0. 6的菌液。所述的诱导表达过程为将经过抗生素筛选的0De。。为0. 6的菌液加入IPTG至终浓度 为lmmol/L, 37。C培养5小时，得诱导表达的培养物。所述的破碎分离纯化过程为取经过诱导表达的培养物离心去上清，沉淀重悬于5ml 0.01M PBS液中，混匀菌液，20kHz超声破碎，离心收集包涵体沉淀，将包涵体沉淀用6M 盐酸胍溶解，采用镍琼脂糖凝胶柱过柱分离，10mM咪唑和20mM咪唑各洗涤一次，最后采 用5ml 500mM咪唑洗脱，洗脱液采用PBS透析，纯化获得人鼻咽组织特异性基因C10RF102 编码融合蛋白。所述的C10RF102编码蛋白多抗的制备方法用纯化的C10RF102编码融合蛋白免疫新 西兰兔，采血制备抗血清，再采用免疫沉淀法或亲和层析法分离获得抗C10RF102多克隆抗体o所述的C10RF102编码蛋白单抗的制备方法用纯化的C10RF102编码融合蛋白免疫小鼠后收集腹腔巨噬细胞及小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，然后筛选阳性 克隆细胞培养，再将阳性克隆细胞注射到BALB/C小鼠腹腔，收集小鼠血清或腹水；最后 将收集的血清或腹水釆用免疫沉淀法或亲和层析法分离获得抗C10RF102单克隆抗体。还 可以将所述的阳性克隆细胞培养，收集培养液上清，采用免疫沉淀法或亲和层析法分离获 得抗C10RF102单克隆抗体。C10RF102编码蛋白多抗的具体制备方法用纯化的C10RF102融合蛋白免疫新西兰兔， 剂量为400ug/kg，第3天和第28天各加强免疫一次，剂量为200ug/kg，第35天采血收集 血清。血清先用正辛酸沉淀血红蛋白及白蛋白，离心去除沉淀，上清继续采用50%饱和度 (NH4)2S(V溶液沉淀，离心，去上清，沉淀即为免疫球蛋白IgG组分，所得为抗C10RF102 多克隆抗体。亲和层析法采用Pierce公司的亲和层析纯化试剂盒，具体步骤严格按Pierce 公司的说明书进行，纯化出抗C10RF102的IgG，并用亲和层析纯化。C10RF102编码蛋白单抗的具体制备方法用纯化的C10RF102融合蛋白免疫BALB/C小 鼠，首次剂量为300ug/kg，加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4左右。每2 3周加强免疫 一次，共免疫4次，收集腹腔巨噬细胞及小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞， 在HAT培养基中进行选择性培养，经过克隆选择，筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交 瘤细胞，继续体外培养，腹腔注射BALB/C小鼠，收集动物血清或腹水；也可大量培养杂 交瘤细胞，收集培养液上清。血清、腹水或培养基上清采用正辛酸沉淀血红蛋白及白蛋白， 离心去除沉淀，上清采用50。/。饱和度(NH4)2S04溶液沉淀，离心，去上清，沉淀即为免疫球 蛋白IgG组分，重溶于PBS缓冲液，所得为抗C10RF102单克隆抗体。亲和层析法采用Pierce 公司的亲和层析纯化试剂盒，具体步骤严格按Pierce公司的说明书进行，纯化出抗 C10RF102的IgG，并用亲和层析纯化。本发明采用多聚酶链式反应(PCR)方法克隆C10RF102基因蛋白编码序列，构建该基 因的融合表达载体，导入RosettaBlue(DE3)大肠杆菌中，IPTG诱导其在大肠杆菌中的表 达，采用镍琼脂糖凝胶柱纯化融合蛋白，并进一步制备兔多抗及小鼠单抗。免疫组化和 western blot结果表明C10RF102基因产物特异性表达与人鼻咽和气管相对特异性表达， 而在其他组织中未检测到明显表达。RT-PCR和免疫组化分析表明，C10RF102基因在鼻咽 癌细胞系HNE1、 5-8F、 6-10B和80。/。的鼻咽癌活检标本中表达下调。本发明利用鼻咽组织特异性基因和鼻咽癌易感基因，对在鼻咽组织特异性表达且在鼻 咽癌表达下调基因C10RF102的编码蛋白。C10RF102基因编码产物及其抗体的制备将为鼻 咽癌的基因诊断和基因靶点治疗提供新的手段。基因诊断的特点是灵敏度高、特异性强、取材一般不受组织或时相限制，应用C10RF102基因在人鼻咽组织特异性表达且在鼻咽癌 中下调的特征，制备诊断试剂盒，用以早期诊断鼻咽癌，能够实现鼻咽癌的早诊断、早发 现和早治疗。同时，以鼻咽组织特异性基因C10RF102为靶点，设计和开发鼻咽癌特异性 的化学治疗药物，是一种全新的鼻咽癌治疗策略，有望实现鼻咽癌的无创性、根治性治疗。
图1为C10RF102融合蛋白在大肠杆菌中的原核表达；图2为western blot结果显示C10RF102蛋白在人鼻咽、气管组织中特异性表达； 图3为免疫组化结果显示C10RF102蛋白在人鼻咽、气管粘膜上皮细胞中特异性表达;A为鼻咽上皮阴性血清对照；B:鼻咽柱状上皮；C:鼻咽鳞状上皮；D:气管；E:支气管与肺；F:肾脏；G:心脏；H:肝脏；I:胰腺；J:胃粘膜。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明。 实施例11) His-C10RF102融合蛋白的原核表达①根据C10RF102基因参考序列(Genebank Accession NM一145047)设计特异性引物，C10RF102-forward:5， -ATACATATGTCG GTGCGCACGTTACCG -3， ， C10RF102-reverse: 5， -CTCGAGCTATAACTCATCCATCAT -3，。引 物序列5'端带NdeI酶切位点，3'端引物带XhoI酶切位点。②以人胎脑cDNA文库质粒 (Clontech公司产品)为模板，PCR扩增C10RF102基因的编码区，回收PCR产物条带。 用Nde I和Xho I酶切PCR回收产物以及pET28b载体(Novagen公司商品化表达载体)。胶 回收试剂盒回收线性的5. 3kb的载体、C10RF102基因编码区。③将pET28b载体与C10RF102 基因连接，构建成符合阅读框的融合基因。用含融合基因的pET28b-C10RF102质粒转化大 肠杆菌JM109,小量制备质粒DNA， Nde I和Xho I酶切鉴定是否含有插入片段，含有插入 片段的阳性克隆质粒DNA纯化后用DNA自动测序仪测序。④将测序鉴定正确的 pET28b-C10RF102质粒转化大肠杆菌RosettaBlue(DE3) ( Novagen公司商品化表达菌株)， 将pET28b-C10RF102重组质粒转化的大肠杆菌，接种于含有200 ug/ml卡那霉素的细菌培 养皿上，37"培养14-20小时，沾取单个菌落接种入3ml含有200 ug/ml卡那霉素、3化g/ml 氯霉素和12. 5ng/ml四环素的LB培养液中，37"C过夜培养;将lml过夜培养物接种至100ml 含有200 ug/ml卡那霉素、34pg/ml氯霉素和12. 5ng/ml四环素的LB培养液中，于37'C培 养3小时至006。。为0.6，加入IPTG至终浓度为lmmol/L， 37°。培养5小时，取培养物离心去上清，沉淀重悬于5ml 0.01M PBS液中，混匀菌液，20kHz超声破碎，离心收集包涵体 沉淀，重悬于lml PBS,取10ul加入3ul 6XSDS凝胶加样缓冲液，热变性之后在12%SDS-PAGE 胶中进行电泳，80-120室温电泳5小时，考马斯亮蓝染色，观察到C10RF102融合蛋白的 表达。2)融合蛋白的分离纯化将包涵体沉淀用6M盐酸胍完全溶解，采用镍琼脂糖凝胶柱 过柱分离，IO慮咪唑和20mM咪唑各洗涤一次，最后采用5ml 500mM咪唑洗脱，洗脱液采 用PBS透析，纯化获得融合蛋白。实施例2C10RF102编码蛋白的抗体制备C10RF102编码蛋白多抗的制备收获纯化的融合蛋白免疫家兔，首次剂量为400ug/kg， 第3天加强免疫一次，剂量200ug/kg，第28天继续加强免疫一次，剂量200ug/kg， 一周 后采血获得抗血清。抗血清先用正辛酸沉淀血红蛋白及白蛋白，离心去除沉淀，上清采用 5(m饱和度(NH4)2S04溶液沉淀，离心，去上清，沉淀即为免疫球蛋白IgG组分，所得为抗 C10RF102多克隆抗体。亲和层析法采用Pierce公司的亲和层析纯化试剂盒，具体步骤严 格按Pierce公司的说明书进行，纯化出抗C10RF102的IgG，并用亲和层析纯化。C10RF102编码蛋白单抗的制备收获纯化的融合蛋白免疫小鼠，首次剂量为300ug/kg， 加强免疫的剂量约为首次剂量的1/4左右。每2 3周加强免疫一次，共免疫4次，收集腹 腔巨噬细胞及小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，在HAT培养基中进行选择 性培养，经过克隆选择，筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，继续体外培养， 腹腔注射BALB/C小鼠，收集动物血清或腹水；也可大量培养杂交瘤细胞，收集培养液上 清。血清、腹水或培养基上清采用正辛酸沉淀血红蛋白及白蛋白，离心去除沉淀，上清采 用50%饱和度(朋4);04溶液沉淀，离心，去上清，沉淀即为免疫球蛋白IgG组分，重溶于 PBS缓冲液，所得为抗C10RF102单克隆抗体。亲和层析法采用Pierce公司的亲和层析纯 化试剂盒，具体步骤严格按Pierce公司的说明书进行，纯化出抗C10RF102的IgG，并用 亲和层析纯化。
权利要求
1、人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白的制备方法，其特征在于，所述的制备方法的具体步骤为根据C10RF102基因序列设计特异性引物，C10RF102-forward5’-ATACATATGTCGGTGCGCACGTTACCG-3’，C10RF102-reverse5’-CTCGAGCTATAACTCATCCATCAT-3’，以人胎脑cDNA文库质粒为模板，PCR扩增出C10RF102基因编码区；用Nde I和Xho I酶切PCR扩增出的C10RF102基因编码区和pET28b载体，再将回收的5.3kb长的pET28b载体片段和C10RF102基因编码区连接，构建成含融合基因的pET28b-C10RF102载体，将含融合基因的pET28b-C10RF102载体转入大肠杆菌RosettaBlue(DE3)中，再将转化的大肠杆菌经抗生素筛选、诱导表达、破碎分离纯化即得人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白。
2、 根据权利要求1所述的人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白的制备方法，其 特征在于，所述的引物序列5'端带Nde I酶切位点，3'端引物带Xho I酶切位点。
3、 根据权利要求1所述的人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白的制备方法，其 特征在于，所述的抗生素筛选过程为将所述的pET28b-C10RF102重组质粒转化的大肠杆 菌，接种于含有200 ug/ml卡那霉素的细菌培养皿上，37。C培养14-20小时，沾取单个菌 落接种入3ml含有200 ug/ral卡那霉素、34吗/ml氯霉素和12. 5pg/ml四环素的LB培养液 中，37'C过夜培养；将lral过夜培养物接种至100ml含有200 ug/ml卡那霉素、34pg/ml 氯霉素和12. 5ng/ml四环素的LB培养液中，于37'C培养3小时至OD,为0. 6，得00600为 0.6的菌液。
4、 根据权利要求1或3所述的人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白的制备方法， 其特征在于，所述的诱导表达过程为将经过抗生素筛选的ODe。。为0.6的菌液加入IPTG 至终浓度为lmmol/L， 37t:培养5小时，得诱导表达的培养物。
5、 根据权利要求4所述的人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白的制备方法，其 特征在于，所述的破碎分离纯化过程为取经过诱导表达的培养物离心去上清，沉淀重悬 于5ml 0. 01M PBS液中，20kHz超声破碎，离心收集包涵体沉淀，将包涵体沉淀用6M盐酸 胍溶解，采用镍琼脂糖凝胶柱过柱分离，lOmM咪唑和20mM咪唑各洗涤一次，最后采用5ml 500mM咪唑洗脱，洗脱液采用PBS透析，纯化获得人鼻咽组织特异性基因C1ORF102编码融合蛋白。
6、 权利要求1所述的C10RF102编码蛋白多抗的制备方法，其特征在于用纯化的 C10RF102编码融合蛋白免疫新西兰兔，采血制备抗血清，再采用免疫沉淀法或亲和层析法 分离获得抗C10RF102多克隆抗体。
7、 权利要求1所述的C10RF102编码蛋白单抗的制备方法，其特征在于用纯化的 C10RF102编码融合蛋白免疫小鼠后收集腹腔巨噬细胞及小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合制 备杂交瘤细胞，然后筛选阳性克隆细胞培养，再将阳性克隆细胞注射到BALB/C小鼠腹腔， 收集小鼠血清或腹水；最后将收集的血清或腹水采用免疫沉淀法或亲和层析法分离获得抗 C10RF102单克隆抗体。
8、 根据权利要求7所述的C10RF102编码蛋白单抗的制备方法，其特征在于将所述 的阳性克隆细胞培养，收集培养液上清，采用免疫沉淀法或亲和层析法分离获得抗 C10RF102单克隆抗体。
全文摘要
人鼻咽组织特异性基因C10RF102编码蛋白及其抗体的制备。本发明采用多聚酶链式反应克隆C10RF102基因蛋白编码序列，构建该基因的融合表达质粒，导入RosettaBlue(DE3)大肠杆菌中，诱导并纯化C10RF102蛋白，并制备出单抗和多抗。C10RF102基因编码产物在人鼻咽组织特异性表达且在鼻咽癌中表达下调，C10RF102基因编码产物及其抗体的制备将为鼻咽癌的基因诊断和治疗提供新的手段，能够实现鼻咽癌的早诊断、早发现和早治疗。
文档编号C07K16/18GK101503701SQ20091004283
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者玮 刘, 波 向, 张文玲, 梅 易, 李夏雨, 李小玲, 李桂源, 理 王, 谭怡忻 申请人:中南大学