专利名称：从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法及专用磁性分离器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法及专用磁性分离器。
背景技术：
在医院或科研工作中经常要在血清、血浆、全血或乳汁、唾液、分泌液、胸腔积液、尿 液、精液、月经血、阴道分泌物、粪便、脑脊液等包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化 核酸的检测。现有分离纯化核酸的常规方法有(1)酚提取/沉淀法将细胞裂解后离心分离
含核酸的水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇(25 :24 : i体积)混合液，两相经漩涡振 荡混匀(适用于分离小分子量核酸)或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸)后离心分 离，再将核酸盐用有机溶剂沉淀，通过沉淀浓縮核酸，改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除 某些杂质分子。(2)层析法，层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析 方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法。(3)密度梯度离心法，采用氯化 铯作为密度梯度离心的标准介质，梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带 经紫外灯照射，产生荧光而被检测，用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化 铯而获得纯化的核酸。上述分离纯化核酸的方法需要用到的试剂较多，步骤较繁琐，且分离 纯化后所得到的核酸纯度不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法。以 实现操作步骤简单快速、使用试剂少，所获得的核酸纯度更高。
本发明的目的还在于提供一种专用于本方法的磁性分离器。
从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法包括以下步骤
(1)裂解释放核酸将待分离的样品加入离心管中，按已有技术加入裂解液进行裂解 用涡旋仪将裂解液与样品溶液充分混匀，放置3-5分钟；温度为室温,最好是高于2(TC;
3在室温条件下，在上述裂解液与样品溶液混合液中加入PH为7.0±0.5 的含固相载体的缓冲溶液中，核酸分子被固相载体吸附包被，混勾后置于磁性分离器上，放 置5-10分钟，磁性颗粒被磁性底座内的磁铁吸引而聚集在离心管壁一侧；
(4) 洗涤纯化卜3次加入无机洗涤液和有机疏水物，充分混匀后再次置于磁性分离器 上，上层疏水环境中核酸更好地结合到磁性颗粒，而下层的无机物将杂质溶解。将移液枪深 入离心管底，先逐步将杂质及无机物吸到移液枪头中，最后吸出有机物，剩下包被有核酸的 磁性颗粒；
所述固相载体是磁性颗粒、硅土、硅胶、玻璃基质等； 所述磁性颗粒是包被有高交联聚苯乙烯的铁氧化物，直径为lum。
所述无机洗涤液是lOOmM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH 7.5±0.5)和lmM EDTA乙二 胺四乙酸的混合液.所述有机疏水物为矿物油或石蜡油。
所述包含核酸的病毒或细胞的样品包括血清、血浆、全血、乳汁、唾液、分泌液、胸腔 积液、尿液、精液、月经血、阴道分泌物、粪便、脑脊液、细菌。
本发明专用磁性分离器是由磁性底座和离心管架二部分活动连接而成，所述磁性底座是 由一个长条形空座和二端的插孔组成，在长条形空座内腔均匀分布有磁铁，所述离心管架上 设有二排共10-30个离心管孔，在离心管架的二端设有可插入磁性底座二端插孔的插条。
本发明的优点只需要加入简单的两种溶液，采用一个磁性分离器就可以完成对核酸的 分离和纯化，简化了设备，操作过程简单快速、使用试剂少。使核酸分子的分离数量增加， 能够通过一个流程同时有效地分离和纯化双链DNA、单链DNA和RNA分子，所获得的核酸纯 度更高。
图1和图2是用无机相加有机相纯化荧光定量PCR检测定量结果图； 图3和图4是用普通的无机相纯化荧光定量PCR检测定量结果图； 图5是磁性分离器组装示意图； 图6为磁性分离器整体示意图。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作出进一步说明
实施例1:血清中乙型肝炎病毒核酸的提取和分离纯化。
取含乙肝病毒核酸的血清300 ul,加入250ul裂解液2%Chelex-100树脂，其基质为聚 苯乙烯二乙烯基苯)、2%SDS (十二烷基磺酸钠)、1% Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚) 混合组成，混匀，简单离心后加入100ul第二种溶液(PH为7.0±0.5的含固相载体的缓冲 溶液)，本实施例是用200rnM HEPES ,4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷 磺酸(pH7.0士0.5)、誦aCl (氯化钠)、300ug/ml magnetic beads(磁性微球)混合组成， 这里的磁性微球即固相载体，是包被有高交联聚苯乙烯的铁氧化物，震荡混匀，室温放置10min 后简单离心。将样品试管置于磁性分离器，5min后待磁珠完全吸附于试管壁，从试管底部缓 慢将上清液吸出。
加入600ul第三种溶液(无机洗涤液)，100mM Tris-HCl (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐 (pH 7.5±0.5) 、 lraM EDTA乙二胺四乙酸混合组成)和200ul第四种溶液(有机疏水物) 矿物油，震荡混匀使磁珠完全悬浮，简单离心后将样品管置于磁珠分离器，待磁珠完全吸附 于试管壁，上清液分为两层(上层为有机相，下层为无机相)，从试管底部将液体(包括上 述有机相和无机相)完全吸出。用移液器吸取50ul核酸回收液反复几次将吸附于管壁的磁 珠完全洗脱，转移即可。
对此转移的核酸回收液(50ul)运用荧光定量PCR扩增对起始浓度进行定量检测，与未 经过此提取、分离纯化步骤，直接进行荧光定量PCR扩增检测结果相比较。同样的样品，经 过此纯化步骤的定量结果比未经过此纯化步骤的定量值高约2倍。
实施例2 :乳汁(牛奶)中乙型肝炎病毒核酸的提取和分离纯化。
因乳汁或牛奶中脂肪等杂质较多，采用了两组对比实验来观察本发明在核酸分离和纯化 中的作用。
第一组加入250ul第一种溶液(裂解液)，随后加入待分离的样品(含乙肝病毒核酸 的乳汁或牛奶等)300 ul,加入200ul第四种溶液(有机相)，混匀，简单离心。加入100ul第二种溶液(吸附包被核酸)的磁珠混合液，震荡混匀，室温放置10min后简单离心。将样 品试管置于磁性分离器，5min后待磁珠完全吸附于试管壁，溶液分为两层(上层为有机相， 下层为无机相，第一次纯化)，从试管底部缓慢将上清液吸出。
加入600ul第三种溶液(无机相)和200ul第四种溶液(有机相)，震荡混匀使磁珠完 全悬浮，简单离心后将样品管置于磁珠分离器，待磁珠完全吸附于试管壁，上清液分为两层 (上层为有机相，下层为无机相，第二次纯化)，从试管底部将液体(包括上述有机相和无 机相)完全吸出。用移液器吸取50ul ，核酸回收液反复几次将吸附于管壁的磁珠完全洗脱， 转移即可。
第二组不加第四种溶液(有机相)，即仅用普通的无机相去除杂质。
两组实验所要获得的目的核酸均为己知的用牛奶稀释的低浓度HBV-DNA。运用实时荧光 定量PCR检测来观察两组各自的定量结果。
每组均选取了16个样品，两个浓度即10IU/ml和20IU/ml，第一组运用本发明的原理， 经过两次纯化后10 IU/ml和20 IU/ml的样品均得到了扩增，第二组未经过此纯化的10 IU/ml 样品仅两个扩增，且扩增曲线明显劣于第一组。
由此可以得出结论，运用本发明对目的核酸进行纯化，可以提高试剂检出的灵敏度，所 获得的核酸纯度更高。
实施例3:
结合附图5和图6:
磁性分离器是由磁性底座B和离心管架A 二部分活动连接而成。磁性底座是由一个长条 形空座1和二端上部的椭圆形插孔2组成，磁铁3是将磁条通过长条形空座1的插孔9插入， 使长条形空座1内腔均匀分布有磁铁。在磁性底座的中部设有圆椎形固定插孔4。在离心管 架上设有16-28个离心管孔5，在离心管架的二端设有可插入磁性底座二端插孔的插条6，插 条6上端7是椭圆形。在离心管架中部设有可插入固定孔的圆椎形插条8。
权利要求
1. 一种从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)裂解释放核酸将待分离的样品加入离心管中，按已有技术加入裂解液进行裂解用涡旋仪将裂解液与样品溶液充分混匀，放置3-5分钟；温度为室温，最好是高于20℃；(3)磁性分离在室温条件下，在上述裂解液与样品溶液混合液中加入PH为7.0±0.5的含固相载体的缓冲溶液中，核酸分子被固相载体吸附包被，混匀后置于磁性分离器上，放置5-10分钟，磁性颗粒被磁性底座内的磁铁吸引而聚集在离心管壁一侧；(4)洗涤纯化1-3次加入无机洗涤液和有机疏水物，充分混匀后再次置于磁性分离器上，上层疏水环境中核酸更好地结合到磁性颗粒，而下层的无机物将杂质溶解。将移液枪深入离心管底，先逐步将杂质及无机物吸到移液枪头中，最后吸出有机物，剩下包被有核酸的磁性颗粒；
2. 根据权利要求1所述的从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法,其特 征在于，所述固相载体是磁性颗粒、硅土、硅胶、玻璃基质；所述磁性颗粒是包被有高交联 聚苯乙烯的铁氧化物。
3. 根据权利要求1所述的从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法,其特 征在于，所述禾机洗涤液是100 mM的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH 7. 5±0. 5)和lmM乙 二胺四乙酸的混合液.所述有机疏水物为矿物油或石蜡油。
4. 根据权利要求1所述的从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法,其特 征在于，所述包含核酸的病毒或细胞的样品包括血清、血浆、全血、乳汁、唾液、分泌液、 胸腔积液、尿液、精液、月经血、阴道分泌物、粪便、脑脊液、细菌。
5. —种分离纯化核酸的专用磁性分离器，其特征在于，是由磁性底座和离心管架二部分 活动连接而成，所述磁性底座是由一个长条形空座和二端的插孔组成，在长条形空座内腔均 匀分布有磁铁，所述离心管架上设有二排共10-30个离心管孔，在离心管架的二端设有可插 入磁性底座二端插孔的插条。
全文摘要
本发明公开了一种从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法及专用磁性分离器。本发明的方法包括(1)按已有技术加入裂解液裂解释放核酸；(2)核酸分子在磁性分离器上进行磁性分离；(3)加入无机洗涤液和有机疏水物洗涤纯化1-3次。本发明只需要加入简单的两种溶液，采用一个磁性分离器就可以完成对核酸的分离和纯化，简化了设备，操作过程简单快速、使用试剂少。使核酸分子的分离数量增加，能够通过一个流程同时有效地分离和纯化双链DNA、单链DNA和RNA分子，所获得的核酸纯度更高。
文档编号C07H21/00GK101481400SQ20091004243
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月7日 优先权日2009年1月7日
发明者戴立忠, 熊晓燕, 蔡鸣镝 申请人:戴立忠